Каталка — ходунки — прыгунки «Слоник» 3 в 1 Fisher-Price

• без залога
   
• бесплатная
  доставка
• гарантия
  чистоты

 Каталка Fisher-Price «Слоник» — настоящий многофункциональный игровой и развивающий комплекс для малышей от 6 месяце, который включает в себя — ходунки, каталку и игрушку-попрыгушку, садясь на которую ребенок будет пружинить-прыгать и тренеровать свои ножки.

Держась за удобную ручку малыш сможет самостоятельно научиться ходить, двигая каталку вперед. На голове каталки находятся большие кнопки, нажимая на которые раздадутся забавные звуки, фразы и песни, при этом некоторые кнопки будут светиться, что безусловно нравится всем малышам. 
Каталка издает забавные звуки, фразы, проигрывает целые песенки. Всего более 30 различных звуковых эффектов. 

Срок аренды:

• У слоника есть вращающийся гремящий барабанчик, пчелка на пружинке, светятся яркие огоньки, кнопки с веселой музыкой и забавными звуками, большие мягкие красные уши — все что нужно для развлечений малыша!
• У дружелюбного слоненка нежно-голубого цвета две ручки: первая расположена на голове, а вторая на задней части, с легкостью убираясь и устанавливаясь, она служит и как спинка.
• Держась за удобную ручку малыш сможет самостоятельно научиться ходить, двигая каталку вперед.
• На голове каталки находятся большие кнопки, нажимая на которые раздадутся забавные звуки, фразы и песни, при этом некоторые кнопки будут светиться, что безусловно нравится всем малышам.
• Каталка издает забавные звуки, фразы, проигрывает целые песенки.
• Всего более 30 различных звуковых эффектов.
• Каталка выполнена из качественного пластика, легко складывается для ее перевозки или хранения.
• Игрушка расчитана длядетей до 25 кг
• Размер самой игрушки (ДхШхВ): 76.2 x 22.9 x 40.6 см.

Вес: 1.6 кг.
Производитель: Fisher Price (США).

Комплектация товара, если она указана в описании, указывается полной. Для незначительной части товаров комплект может быть неполный ввиду потери некоторых аксессуаров в процессе использования. Также для некоторых товаров мы выдаем малозначимые аксессуары по требованию. Поэтому, пожалуйста, уточняйте комплектацию товара при заказе, если она для вас важна.

Fisher Price — Игрушки — OLX.ua

Игрушка-каталка Fisher-Price Слоник Y8651 | f-price.com.ua

Іграшка-каталка Fisher Price «Слоник» обов’язково стане другом Вашого малюка і супутником під час прогулянок.

Яскравий, милий слоник-Катака під час руху продемонструє малюкові навички циркового артиста-жонглера. Під час руху різнокольорові кульки, всередині прозорого хобота, будуть перекочуватися зі швидкістю, відповідної швидкості пересування малюка.

Ергономічна ручка-тримач-штовхач з високоякісного пластику створена спеціально для дитячих ручок.

Малюкові сподобається бігати зі слоником, адже він такий кумедний. Каталка допоможе навчитися малюкові ходити впевненіше і зробить прогулянку цікавіше. Іграшка сприяє розвитку розуміння причинно-наслідкових зв’язків, стимулює дитину до активних рухів і розважає.

• Вік: від 12 до 36 мiсяців
• Матерiал: пластик
• Розмір: 18 см х 15 см х 21 см
• Висота ручки: 45 см
• Розмір коробки: 36 см х 29 см х 14 см
• Виробник: Fisher Price

• Вік: від 12 до 36 мiсяців
• Матерiал: пластик
• Розмір: 18 см х 15 см х 21 см
• Висота ручки: 45 см
• Розмір коробки: 36 см х 29 см х 14 см
• Виробник: Fisher Price

У вас есть возможность получить заказ в нашем шоуруме. Для этого необходимо оформить заказ на сайте или по телефону. Когда ваш заказ будет готов к выдаче, вы получите sms-сообщение.

Шоурум находится в центре Киева, по адресу Киев, ТЦ «Бессарабский квартал»

Если вас заинтересовал один из доступных товаров в шоуруме, обязательно зарезервируйте товар.

Способы оплаты при самовывозе:

• Наличными
• Картами Visa и MasterCard
• Безналичная оплата

Курьером по Киеву

Доставка по Киеву осуществляется с понедельника по субботу, с 10:00 до 20:00

При заказе от 500 грн доставка в пределах Киева бесплатная.

Стоимость доставки заказа до 500 грн в пределах Киева составляет 50 грн.

Доставить ваш заказ мы стараемся максимально быстро. Как правило, доставляем в день поступления заказа или на следующий день (при наличии товара на ближайшем складе).

Менеджер при подтверждении заказа согласует с вами удобный для вас временной интервал и условия  доставки.

Способы оплаты:

• Наличными
• Предоплата Privat24
• Безналичная оплата

По Украине

По Украине доставка осуществляется компанией «Новая почта» на удобное Вам отделение.

Срок доставки, как правило, 1-2 дня с момента отправки.

При заказе от 1500 грн доставка по Украине Новой Почтой бесплатная.

Стоимость доставки заказа до 1500 грн «Новой почтой» наложенным платежом: 80 грн

Стоимость доставки заказа до 1500 грн «Новой почтой» с предоплатой (Приват 24): 40 грн

Способы оплаты:

• Наличными при получении. На почтовом отделении вы сможете осмотреть товар в присутствии работника «Новой Почты».
• Предоплата Privat24
• Безналичная оплата

ДЭН ГЕРНИ 1965 АВГУСТА ПРОДАЖИ МОТОРОВ GALAXIE 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ Игрушки и хобби Автомобили: Гонки, NASCAR travelindiapro.com

ДЭН ГЕРНИ, 1965, АВГУСТА, ПРОДАЖИ МОТОРОВ, ГАЛАКТИКА, 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ, игрушки и хобби, Машины: Гонки, NASCAR travelindiapro.com

Гоночная серия:: NASCAR: MPN:: 24DGAMS65UOR, Год автомобиля:: 1965: Водитель:: DAN GURNEY, Состояние :: Новое: Совершенно новый, DAN GURNEY 1965 AUGUSTA MOTOR SALES GALAXIE 1/24 UNIVERSITY OF RACING CAR, неиспользованный , Марка автомобиля:: Ford: Масштаб:: 1:24, включая изделия ручной работы, См. Все определения условий: Модель: GALAXIE, ОЧЕНЬ ОГРАНИЧЕННАЯ ПРОДАЖА ПО ВСЕМУ МИРУ.Серия:: NASCAR: Цвет:: RED. Тема:: NASCAR: Тип:: NASCAR. неповрежденный предмет, Семейство персонажей:: NASCAR: UPC:: 781317013784, Страна / регион производства:: США: Racing Team:: AUGUSTA MOTOR SALES, для получения полной информации см. список продавца. Бренд:: УНИВЕРСИТЕТ ГОНКИ: Изменен Элемент:: Нет, Материал:: ДИЕКАСТ: Организация:: NASCAR, закрытый, ЭТО ДАН ГЕРНИ, 1965 АВГУСТА ПРОДАЖИ МОТОРА С ОТКРЫТИЕМ КАПОТА И БАГАЖНИКА.

ДЭН ГЕРНИ 1965 АВГУСТА ПРОДАЖИ МОТОРОВ ГАЛАКТИКА 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ

Infinity Haqqislam Sekban Специальное военно-морское подразделение NIB. Минифигурка Kai ZX с броней NJO032 LEGO Ninjago для продажи в Интернете, Книга игрушек для детей дошкольного возраста с овощами для малышей. ДЭН ГЕРНИ 1965 АВГУСТА ПРОДАЖА МОТОРА ГАЛАКТИКА 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ , G.I Joe 25th Cobra Para Viper Trooper Figure Complete w / File Card. 1:35 Модельный набор для гражданских лиц Набор 1 из высококачественной пластмассы, Chevrolet Chevelle Malibu Hard-Top 1974 Light Blue Met NEOSCALE 1:43 NEO47186 Mo. ДЭН ГЕРНИ 1965 АВГУСТА ПРОДАЖИ МОТОРОВ ГАЛАКТИКА 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ , Star Wars Clone Wars CW16 блестящая разработка Super Dróide De Batalha Solto Completo. Fisher-Price Imaginext DC Super Friends Wonder Woman Донна Трой Редкая новинка, подробная информация о игрушке-непоседе Pop Its Finger Pop It Tiktok 2021 NEW Push Bubble Stress Relief Kids. DAN GURNEY 1965 AUGUSTA MOTOR SALES GALAXIE 1/24 UNIVERSITY OF RACING CAR , Action Vinyls The Loyal Subjects GI JOE Wave 2 One Blind Box, 03448 HL CLASSICS Reaper Dark Heaven Legends OOP FEMALE BARBARIANS,

ДЭН ГЕРНИ, 1965, АВГУСТА, ПРОДАЖИ МОТОРОВ, ГАЛАКТИКА, 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ

ДЭН ГЕРНИ, 1965, АВГУСТА, ПРОДАЖИ МОТОРОВ, ГАЛАКТИКА, 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ

GURNEY 1965 AUGUSTA MOTOR SALES ODUCTION ПО ВСЕМУ МИРУ, дополнительные скидки, более низкие цены для всех, лучшее качество, гарантированная оплата, быстрая доставка и 100% гарантия возврата денег! ДЭН ГЕРНИ 1965 АВГУСТА ПРОДАЖИ МОТОРОВ GALAXIE 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ, ДЭН ГЕРНИ 1965 АВГУСТА ПРОДАЖИ МОТОРОВ GALAXIE 1/24 УНИВЕРСИТЕТ ГОНОЧНЫХ АВТОМОБИЛЕЙ.

Обзор

Hunting Elephants: Месть — это блюдо, которое лучше всего подавать, старые

Ссылки на Breadcrumb Trail

1. Фильмы
2. Культура

Когда слоны не производят очередной «возмутительный» взрыв в отвисших пастях своих звезд, они стремятся прямо к soppy сентиментальность

Автор статьи:

David Berry HO

Отзывы и рекомендации объективны, товары выбираются независимо. Postmedia может получать партнерскую комиссию за покупки, сделанные по ссылкам на этой странице.

Содержание статьи

«Банки никогда не грабят ради денег», — говорит безумный, беспомощный актер Патрика Стюарта своим товарищам-грабителям банков в ужасной израильской комедии « Охота на слонов» . «Это всегда из мести или секса».

Пенсионеры-рогоносцы, составляющие три четверти экипажа, посвящают сексу не менее четырех пятых своего мозга, но на самом деле это заговор мести. После того, как их внук Йонатон (Гил Бланк) наблюдает, как его отец-охранник умирает в банке, в котором он работает, а затем банк отказывается выплачивать ему пособие, потому что с ним был его сын, два бывших израильских борца за свободу (Сассон Габай и Мони Мошонов) ) объединиться с полным хамом (Стюарт), чтобы все исправить.

Ветчина и сыр здесь действительно в порядке вещей: когда Elephants не производит очередной «возмутительный» всплеск в отвисших пастях своих звезд, он стремится прямо к сентиментальности, либо из-за потери Йонатона, либо из-за надвигающейся чьей-либо угрозы. смертность. Ни юмор, ни эмоции не являются особенно свежими или откровенными, хотя последнее, по крайней мере, устанавливает сквозную линию: ни один из значимых моментов не поднимается выше шмальца, возможно, потому, что большинство из них следует по пятам за стариками, спотыкающимися друг о друга после того, как они увидеть задницу штанов для йоги.

Стюарт, по крайней мере, улавливает должный уровень неоправданного достоинства в своем буйном выступлении, подстраивая свой сценический баритон ровно настолько, чтобы стать совершенно смешным. Было бы даже лучше, если бы он не был погряз в сценарии, не воспринимавшем его хвастливую широту так буквально.

«Охота на слонов» открывается 15 мая в Оттаве и 29 мая в Калгари.

Интервью с Джеймсом Герни | Городские зарисовщики

Для
Многие читатели, иллюстратор / художник Джеймс Герни не нуждаются в представлении.Его воображаемый мир Динотопия привел в восторг поклонников фантастического искусства, а
вдохновлял художников как молодых, так и старых на протяжении 20 лет.

Совсем недавно
его хорошо проработанные научно-популярные руководства по реалистичной живописи
фантастические сюжеты стали краеугольным камнем в библиотеке любого иллюстратора.
Можно с уверенностью сказать, что он оказал влияние на поколение
иллюстраторы.

Что, пожалуй, менее известно, так это его страсть к живописи и рисованию на природе. Он держит подписчиков своего блога и канала на YouTube в курсе своих приключений в зарисовках.Я настоятельно рекомендую подписаться на оба.

Недавно мне посчастливилось делать наброски с
Джеймс и Жанетт Герни, а также группа художников в их
Группа трех штатов / Новой Англии. Как и следовало ожидать, я обнаружил, что все они
знающие искусствоведы, заядлые рисовальщики и все вокруг великие
люди.

Джеймс любезно согласился на короткое интервью для Urban Sketchers.org.

MTH: Я спросил, есть ли у кого-нибудь из наших скетчеров вопрос к вам.Вот отличное вступительное слово от Кэти Джонсон из Миссури:
«Я
любил Джеймса Герни с момента его самой первой книги, еще в 80-х; В
Руководство художника по рисованию с Томасом Кинкейдом (да, это
Кинкейд — они пошли разными путями!) Двое молодых людей взлетают рисовать
по всей Америке … это восхитительно! «
J.G: Спасибо, Кэти! Мне тоже нравится твоя работа, с тех пор, как я впервые увидел ее в» Иллюстрированной жизни «.

Том
Кинкейд и я были отправлены вместе первокурсниками в Калифорнийский университет.
Беркли, когда нам обоим было по 17 лет.За эти годы мы много работали
рисовать вместе приключения. Я знал его задолго до того, как он стал «Художником света».

ср
оба ходили в одну художественную школу, но мы ушли через пару семестров
потому что мы начали устраиваться на работу, а школа не преподавала то, что мы
хотел узнать. Плюс, после прочтения дорожных приключений Джека
Керуак, Чарльз Куралт и Джон Стейнбек, мы хотели оставить позади
тесные классы без окон и столкнуться с реальным миром с нашими
альбомы для рисования.

Мы набили рюкзаки товарами для искусства и сели в товарный поезд, направляющийся на восток из
Лос.
Анхелес. Мы были слишком разорены для отелей, поэтому спали на кладбищах и
подземных переходов, и мы рисовали резчиков надгробий, лесорубов и
бывшие минусы. Чтобы заработать денег на еду, мы нарисовали двухдолларовые портреты в
бары при свете сигаретных автоматов.

Вот фотография нас с Томом в одинаковых рубашках формы для заправок с нашими альбомами в сельской местности штата Миссури.

ср
добрался до Манхэттена. Мы рисовали город днем, а
Ночью мы спали на заброшенных пирсах и крышах домов. У нас была безумная идея
написать книгу с практическими рекомендациями по рисованию, поэтому мы обошли
издатели. Книг по этой теме было не так много, кроме
книга Ника Меглина «Рисунок на месте» 1976 года. Но наши герои были
старше: Мензель, Гуптил, Ватсон и Каутцки.

Мы выкололи
базовый план книги на бумажных салфетках в Burger King на Верхнем
Западная сторона.Нам никогда не нравилось слово
«Наброски», потому что они подразумевали что-то поверхностное, случайное или
пробный. Мы хотели создавать искусство, основанное на наблюдении, которое было точным и
подробный, но, что более важно, жизненно важный, исследовательский и полностью преданный делу.

ср
в конце концов получил контракт от Watson-Guptill, и книга была
опубликовано в 1982 году. Это как приключение рисования на
дорога, поскольку речь идет о технике. Сейчас его нет в продаже, очень дорого
купить.Перед смертью Тома мы говорили о том, чтобы снова вернуть его в печать,
но мы просто были слишком заняты другими проектами.

MTH: Как это приключение повлияло на работу вашего местоположения?
J.G:
Одним из последствий этой поездки для нас обоих было то, что мы выработали здоровый образ жизни.
уважение к тому, как разные люди смотрят на произведения искусства. Настроили немного
выступить на чемпионате штата Миссури по охоте на енотов с целью
делать портреты любимых собак. Владельцы были очень
в частности о пропорциях и маркировке собак, и они не были
заплатит нам два доллара, которые мы просили, если мы не получим подробностей
Правильно.Это была более жесткая критика, чем мы когда-либо получали в художественной школе.

MTH:
Как продолжение этого, вы хорошо известны своими фантастическими произведениями.
искусство, и ваши яркие осознания древней истории (я думаю о
National Geographic в работе). Они кажутся идеальными предметами для
иллюстратор — изображающий то, что больше (или никогда не существовало), но
делая их как можно более реальными. Как городской рисовальщик, естественно, я
Интересно, сколько из этого вы приписываете своим фоновым наброскам? Что
отношения между наблюдением за миром и визуализацией вашего
воображение?
Дж.G:
Да, внутренний глаз и внешний глаз. Эти двое неразделимы. Несколько раз я
должен был путешествовать по исследовательским заданиям для National Geographic с
арт-директор Дж. Роберт Теринго, который также был фанатиком зарисовок и
Выпускник Школы именитого художника.

ср
привезли наши акварели в Израиль, Иорданию и Петру, пока
исследования археологической истории о Палестине во времена
Цезарь. Я тоже захватил фотоаппарат, но геолокация была больше
полезный.Было нетрудно представить, как часы повернулись ко времени
до изобретения фотографии, когда художники были необходимы
археологические экспедиции.

Вы
упомянуть фантастическую работу. Я, наверное, больше всего известен тем, что писал и
иллюстрирующий Динотопию, книгу о мире, где люди и
динозавры сосуществуют. Вся посылка Dinotopia построена в 19 веке.
исследователь по имени Артур Денисон, документирующий новый мир с его
альбом для рисования. Идея Dinotopia пришла прямо из моего путешествия
зарисовки дней с Кинкейдом и моих полевых исследований зарисовками для National
Географический.

MTH:
Вы бы сказали, что все ваши основные работы имеют какой-то элемент поля?
учиться? Что случается чаще — идея творческой работы, которая
требует от вас проведения полевых исследований или зарисовки места, которое
вдохновляет студийную живопись?

Идет
в обе стороны. Наброски с натуры определенно расширяют мой визуальный словарный запас,
что помогает, когда я пытаюсь создать фантастический мир из воздуха. я
часто копаюсь в своих альбомах в поисках позы, скал, деревьев,
эффекты пейзажа или другие детали.Это одна из причин, по которой мне нравится
нарисуй все. Как сказал Адольф Мензель: «alles Zeichnen ist nützlich,
und alles zeichnen auch »(« Любой рисунок полезен, и рисовать
все тоже. »)

MTH:
Кажется, вам нравится рисовать эскизы, чтобы получить доступ к закулисью. К
поставьте себя перед необычными предметами, которые многие из нас могут
никогда не получится зарисовать. Какие места самые экзотические?
рисование заняло вас? Когда вы планируете эти миссии, как вы выбираете
стоящая тема? Что входит в ваш список мест, которые необходимо рисовать? Любой
совет для городских зарисовщиков о том, как осуществить эти приключения?
Скорее
чем пересказывать истории, которые я рассказывал в блоге, почему бы мне просто не
упомяните несколько примеров, и люди могут перейти по ссылкам, чтобы получить более полную
описание.

[Завод по производству полумесяцев]

[Опасные районы]

[Лодка в Шанхае]

[Обезьяны в Гибралтаре]

MTH: Есть еще много всего! Блог Джеймса энциклопедичен. Некоторые места экзотические, некоторые более банальные.

J.G .:
У меня нет списка мест, которые нужно обязательно посетить. Меня обычно не интересует
арт-мастерские в Тоскане или туристические места, которые переполнены
с художниками. Я предпочитаю немотивы, маленьких красоток, которые все
проходит мимо.Наброски, которые для меня важнее всего, ближе всего к моим собственным
жизнь. Мне нравится то, что сделал Эндрю Уайет, оставаясь в очень узком
периметр.

MTH:
В сообществе Urban Sketching у нас есть своего рода «эстетическая
согласие », которое мы все делаем набросками из первых рук. (В
по крайней мере, то, что мы решили разместить на этих страницах). В основном это потому, что мы
наслаждайтесь идеей выйти и посмотреть мир. Но это может привести к
предположение, что рисование с жизни всегда лучше, чем рисование с
ссылка.Мы начали затрагивать эту тему во время нашего зарисовки.
но не зашел слишком далеко. У меня сложилось впечатление, что вы мало используете
фотографическая ссылка, или старайтесь избегать ее, когда это возможно. В том, что
в целом правда? Как вы относитесь ко всему этому — от жизни vs.
вопрос фотографии?
J.G .: Я люблю
фотография, и я использую фотореференс в своей студийной работе. Но держи
Имея в виду, что моя специальность — рисовать реалистичные изображения вещей, которые
нельзя фотографировать. Фотографии помогут вам только частично.Для этого
работаю, я создаю макеты и заставляю людей позировать и смотреть на референсы.
Но то, что я на самом деле визуализирую, — это то, что в целом выходит за рамки
досягаемость камеры, например динозавра, древнего римлянина или робота
робот.

Когда я рисую на открытом воздухе наброски, мои цели
Очень разные. Я пытаюсь поймать жизнь в бегах. Я люблю
проблема попытки записать меняющийся свет и движущиеся объекты.

[Масса, C]

чувство срочности, которое оно вызывает во мне, заставляет меня импровизировать и действовать
на интуицию.У меня не было бы причин фотографировать на месте
и работать с ними в студии, потому что это упражнение не имело бы смысла.
цель и не представляет для меня интереса.

MTH: Итак, ваш канал на YouTube потрясающий!
Ваш
мини-документальные фильмы о ваших зарисовках довольно сложны —
закадровый голос, несколько камер, создание отснятого материала, даже отслеживание снимков.
И вы очень щедры на количество контента.
Это
требует много умственной энергии, жонглируя между рисованием
и управление несколькими камерами.Могу я прямо спросить — что заставляет все
чего стоит? Вы — редкий пример, художник, который предпочитает заниматься
все это на месте. Многих из нас это ужасно отвлекает. Пока что
вы умеете делать отличные рисунки и быть режиссером-документалистом
в то же время. (Не то чтобы я пытался заставить вас остановиться — пожалуйста, сделайте
продолжаю снимать эти фильмы).
J.G .: Спасибо.
Зачем я это делаю? Я вырос в семье без художников, не занимался искусством
классы, и я был вроде как одиночка.Так что на протяжении всей моей юности я никогда не
должен смотреть, как кто-то другой рисует или рисует с натуры.

Однажды я
пришел в художественную школу и начал встречаться с другими художниками, я был
полностью увлечен тем, как другие люди снимали. И я был
были очарованы, узнав, о чем они думали, когда они это делали.

я
считают, что рисование на основе наблюдений — это в высшей степени магический акт, например
форма колдовства. Что я пытаюсь сделать со своими видео, так это попытаться
бутылка этой магии, чтобы поймать рыбу и рассказать историю рыбы в то же время
время.

[Sketchbook Pochade — записка Gopro Hero прикреплена к таймеру яиц. Немного изобретательности янки в действии.]

Да,
требуется много внимания, чтобы задокументировать эскиз, в то время как
Я делаю это. Иногда я так заворачиваюсь в кусок, что забываю
получить хорошее освещение.

Но отдельная съемочная группа не может
покрытие, которое я ищу. Они всегда смотрят со стороны. В моем
видео, я не только хочу показать зрителю, что я делаю крупным планом, но и
также позволить им проникнуть в мою голову, чтобы они могли видеть, о чем я думаю.

Другой ответ на вопрос, почему это стоит, заключается в том, что в течение следующих нескольких
лет я буду создавать библиотеку обучающих видео для продажи
подробно показывая, как я использую различные носители и как решаю различные
проблемы.

В 2014 году я буду выпускать видео о акварельной живописи на натуре, а затем и другие пленэры.

MTH:
Есть ли у вас несколько советов для рисовальщика, который хочет запечатлеть свой собственный
работать над видео? Хорошее вводное снаряжение или надежные техники.
J.G .: Давайте начнем с техники — Основные советы по съемке видео с городскими зарисовками:

1. Если вы новичок, используйте штатив и НИКОГДА не панорамируйте или не масштабируйте.

2.
Получите освещение. Снимайте много четырехсекундных клипов. Действительно помогает иметь
хороший диапазон снимков: установочный снимок, некоторые крупные планы, некоторые
палитра или пенал, таймлапс, реакции людей вокруг
вы, а также снимок мотива, на который вы смотрите. Получите немного звука
фоновые звуки и добавить закадровый голос позже, если вы не хотите рассказывать
что вы делаете в реальном времени.Редактировать намного проще, если у вас есть
хорошее освещение, и зрителя расстраивают, если вы этого не сделаете.

3. Купите камеру с ручным управлением, особенно: блокировку фокуса, настраиваемый баланс белого и ручное управление экспозицией, и научитесь ими пользоваться.

4.
Вы можете использовать простую программу редактирования, такую ​​как iMovie. Отредактируйте отснятый материал
насколько это возможно. Искусство в реальном времени, как и жизнь в реальном времени, — это
скучный. Это становится захватывающим только тогда, когда он хорошо отредактирован.

Шестерня:

1.
Я использую относительно недорогое оборудование: видеокамеру Canon Vixia HF R40, камеру
Цифровая зеркальная фотокамера Canon T3i и GoPro Hero2 со звуком, записанным на h2
Увеличить.Я купил все это снаряжение примерно за 1000 долларов.

2. Все
установки для тележек и установки для управления движением — супер дешевые проекты мастерских DIY
используя Лего, метлы и тому подобное.

3. Я узнал
о техниках видеосъемки и монтажа при просмотре YouTube
онлайн-уроки. Я снимаю и редактирую все свои работы.

MTH:
Орлинг Домингес из Доминиканской Республики хотел, чтобы я спросил о вашем
технический процесс. У вас интересный смешанный медиа-подход, открытый для
любой инструмент или технику, которую вы можете комбинировать.Что ты думаешь как ты
собрать все эти разные материалы вместе? Вы разработали
поэтапный процесс по вашему выбору или это больше «наощупь»? Какие
делает что-то подходящее для одного подхода над другим?
J.G .:
Хороший вопрос, Орлинг. В моем наборе для городских зарисовок я приношу художественные принадлежности.
которые полностью совместимы: перьевая ручка водорастворимого цвета
карандаши и графитные карандаши, водяные кисти (одна с водой и
пара других с водорастворимыми цветными чернилами), небольшой Schmincke
набор акварельных кастрюль и несколько тюбиков гуаши.У меня тоже есть масло
малярный набор и казеиновый набор.

[Что в моей сумке?]

Basic
мышление: нет границы между рисунком и живописью, и есть
никаких «пуристических» правил. Все возможно, если только это разумно с точки зрения охраны здоровья.
Я использую любые средства массовой информации или методы, которые передают больше всего информации или настроения в
доступное время. И, конечно, я показываю только то, что разумно
использовать в конкретной ситуации, например, в концертном зале, метро или
ресторан.

[Пленэр Монтерей]

[Акварельные принадлежности Джеймса.Я вижу, я не боюсь быть ботаником. Я ребенок! Мы все одинаковы.]

MTH:
Мне всегда интересно, есть ли у художника философия по этому поводу: что
делает что-то набросок против картины? Эта линия такая размытая?
даже не беспокойся об этом больше?
Я не помещаю ни одного
границы между эскизом и отделкой или между рисунком и
рисование. Мне нравится слово «учиться», потому что оно подразумевает более тщательный
наблюдательный и терпеливый, но работа, выполненная как исследование из жизни, может
иметь мощность и детализацию готовой работы.Исследование не
обязательно средство для достижения цели. Но так как мы должны называть свои работы
что-то, когда мы говорим о них, мы застряли в ограничениях
лексикон.

MTH:
Вы всегда были примером для других художников-самоучек,
высокомотивированный человек, который занимается своим делом. Учитывая это, я
думаю, это отличный заключительный вопрос от Нины Йоханссон из
Стокгольм:
«I
предположить, что Гурни живет за счет своего искусства, и было бы интересно
получить практический совет для тех, кто мечтает об этом.У нас есть
в школе, где я работаю, обсуждали, как
художники обычно не очень хороши в бизнесе, и как бы нам хотелось
чтобы дать нашим студентам-искусствоведам несколько уроков о том, как вести малый бизнес, чтобы
уметь зарабатывать на жизнь — мешает только учебная программа. Хорошо
Посмотрим, как это получится, а пока я хочу показывать им хорошие примеры.
🙂 «
Если
Я могу просто добавить к этому: я предполагаю, что на данном этапе вашей карьеры вы
может делать то, что вы хотите, выбирать свои проекты.Что ты видишь как
самые интересные начинания художников в ближайшее десятилетие?

[Highland Avenue]

Спасибо,
да, это правда, я всегда жил за счет кисти и всегда рисовал
что я хочу. В некоторые годы влетает много денег; в другие годы я делаю
меньше дворника. Но я всегда был счастлив и следил за своей музой.

[Грязевая лужа]

I
верю, что каждый студент, изучающий искусство, должен получить образование в области бизнеса: маркетинга,
контракты, бухгалтерский учет, гласность, и особенно в наш век
создатель-продюсер, важно знать о распространении и продажах.Если этого не предлагают художественные школы, вы можете подобрать его самостоятельно. Я
всегда пытаюсь узнать что-то новое о том, как заниматься любимым делом
платить за мою жизнь.

Тем не менее, я стараюсь продолжать бизнес
соображения, связанные с вождением, что я делаю или как я это делаю. я всего-лишь хочу
получаю удовольствие, выполняя работу самого высокого качества, на которую я способен. Я рада, что
Интернет позволяет мне делиться с другими тем, что я создаю и чему учусь. я
верьте, что достаточно людей поддержат меня, чтобы я продолжал заниматься этим.

[Bleecker and 11th]

Эскиз
from life делает большие шаги вперед, как с Urban Sketchers
и движения пленэра.Некоторые люди зарабатывают на жизнь
эти вещи, но они важны не поэтому. Люди, которые рисуют в
свободное время от другой работы, и профессионалы, которые делают это для
релаксация или обучение не менее важны для движения.

Рабочий
прямо от природы всегда приносило свежую кровь в искусство, и мы
всем повезло жить посреди этого пробуждения.

MTH:
Что ж, спасибо за ваше щедрое время — вы нам отлично подарили
ответы, это было действительно здорово, что вы были с вами! Надеюсь увидеть тебя
зарисовка на улице.Если вы когда-нибудь в дороге, не стесняйтесь смотреть
поднимитесь в местную группу Urban Sketchers, где бы вы ни находились.

Новые инструменты для слонов

Abstract

Несмотря на острую потребность в неинвазивных инструментах для улучшения мониторинга популяций диких животных, особенно исчезающих и неуловимых видов, отбор генетических проб фекалий не был принят в качестве регулярной практики, в основном из-за связанных с этим технических проблем и затрат. Необходимо провести значительную работу по совершенствованию методов сбора и подготовки проб, чтобы улучшить качество набора проб и предоставить экономичные инструменты, которые могут эффективно поддерживать управление дикой природой.В этом исследовании мы собрали обширный набор образцов фекалий лесных слонов ( Loxodonta cyclotis ) по всему Габону, Центральная Африка, и подготовили их для генотипирования с использованием 107 анализов однонуклеотидного полиморфизма. Мы разработали новый анализ количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), нацеленный на фрагмент ядерной ДНК длиной 130 пар оснований, и продемонстрировали его пригодность для деградированных образцов у всех трех видов слонов. Используя этот анализ для сравнения эффективности двух методов отбора проб для выделения фекальной ДНК, мы обнаружили, что отбор пробы всей поверхности навозной кучи с помощью тампона, хранящегося в небольшой пробирке с буфером для лизиса, был удобным методом, обеспечивающим высокий успех экстракции и выход ДНК.Мы смоделировали влияние качества фекалий и времени хранения на концентрацию ДНК, чтобы предоставить рекомендации по оптимизации сбора и хранения. Максимальное время хранения для обеспечения 75% успеха составляло два месяца для образцов, собранных в течение 24 часов после дефекации, и увеличивалось до четырех месяцев для образцов, собранных в течение одного часа. Наконец, количественный анализ ПЦР в реальном времени позволил нам предсказать успех генотипирования и предварительно проанализировать образцы ДНК, что еще больше повысило рентабельность нашего подхода.Мы рекомендуем объединить валидацию эффективного метода отбора проб, наращивание потенциала экстракции ДНК в стране для сокращения времени хранения и разработку количественных ПЦР-анализов для конкретных видов в целях повышения экономической эффективности рутинных неинвазивных анализов ДНК и расширить использование маркеров следующего поколения на неинвазивные образцы.

Образец цитирования: Bourgeois S, Kaden J, Senn H, Bunnefeld N, Jeffery KJ, Akomo-Okoue EF, et al. (2019) Повышение рентабельности фекального генотипирования: новые инструменты для видов слонов.PLoS ONE 14 (1):
e0210811.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811

Редактор: Элисса З. Камерон, Университет Тасмании, АВСТРАЛИЯ

Поступила: 1 июня 2018 г .; Принята к печати: 2 января 2019 г .; Опубликован: 30 января 2019 г.

Авторские права: © 2019 Bourgeois et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Средства для проекта были предоставлены CEEAC в рамках программы ECOFAC V (Хрупкие экосистемы Центральной Африки), финансируемой Европейским Союзом (контракт № FED / 2013 / 332-349).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

С начала 1990-х годов использование неинвазивного анализа ДНК быстро развивалось, позволяя изучать виды, индивидуумов, пол, родство и генетические вариации [1,2], с явными этическими и практическими преимуществами для находящихся под угрозой исчезновения или неуловимые виды [3].С уменьшением лабораторных затрат на анализ и развитием мощных аналитических инструментов неинвазивные исследования генетических популяций становятся все более доступными для управления дикой природой [4–6]. Переписи населения, основанные на неинвазивной идентификации индивидов с помощью ДНК, являются более точными и точными, чем оценки по косвенным признакам для множества неуловимых, малонаселенных или широко распространенных видов [7–9]. Экономическая эффективность неинвазивных исследований ДНК также была продемонстрирована [9], но они сильно зависят от способности преодолевать технические проблемы, связанные с использованием образцов фекальной ДНК.

Двумя основными техническими ограничениями отбора проб фекалий являются сложность восстановления ДНК хорошего качества и высокий риск ошибок генотипирования [10–12]. Образцы фекалий часто содержат ингибиторы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и небольшие количества целевой ДНК и склонны к деградации ДНК и совместному восстановлению нецелевой ДНК. На все эти параметры сильно влияют диета отобранного человека [13,14] и условия окружающей среды, влияющие на образец фекалий в поле.В частности, ДНК быстро деградирует в тропической среде из-за жары, влажности и большого разнообразия микроорганизмов [15,16].

Попытки компенсировать низкий успех экстракции ДНК могут включать увеличение количества собранных образцов фекалий для противодействия низким показателям успешности [5] и оптимизацию протоколов сбора, сохранения или экстракции [17]. Выбор метода отбора проб и условий хранения (в частности, носитель, продолжительность и температура) сильно влияет на качество и количество ДНК, которая может быть извлечена из образцов [18].Многочисленные методы отбора проб и консервации были тщательно протестированы на различных видах с переменным успехом [18–20], однако эмпирические сравнения привели к консенсусу, что методы, нацеленные на внешний слой навоза, в целом более эффективны [21]. Широко используемые методы хранения включают сушку в гранулах диоксида кремния и различных жидких средах для хранения, но их эффективность для сохранения геномной ДНК различается в зависимости от вида и среды обитания [4]. Двухэтапный протокол, состоящий из короткого периода хранения в этаноле с последующим высушиванием кремнезема, был успешно зарегистрирован на образцах копытных животных и приматов, собранных в тропических лесах Центральной Африки [19,22].В области судебной медицины человека мазки широко используются для сбора доказательств с места преступления [23] и оказались очень многообещающими для отбора проб фекалий в некоторых других таксонах и средах [24–26].

Было разработано несколько подходов для уменьшения количества ошибок, связанных с ДНК низкого качества в процессе амплификации. Например, реплицированное генотипирование (подход с использованием нескольких пробирок) стало золотым стандартом для микросателлитного генотипирования, чтобы минимизировать выпадение аллелей в 1990-е годы [27], но оно является дорогостоящим и требует значительных усилий.Совсем недавно маркеры однонуклеотидного полиморфизма (SNP) стали широко доступны [28], при этом тесты SNP менее подвержены ошибкам генотипирования, что снижает необходимость повторного анализа [29]. Благодаря этому они хорошо подходят для неинвазивных проб и представляют собой жизнеспособную альтернативу микросателлитам [30]. Другой подход, позволяющий сбалансировать затраты и усилия с размером образца и частотой ошибок, заключается в оценке образцов фекальной ДНК перед амплификацией. Количественная оценка только общей ДНК недостаточно информативна, поскольку образцы фекалий содержат как ДНК хозяина, так и экзогенную ДНК, а также амплификация одного надежного маркера (например,грамм. маркера пола или 500 пар оснований митохондриальной ДНК), достаточного для фильтрации образцов плохого качества [31,32]. Вместо этого, количественная ПЦР, специфичная для вида, была разработана как более информативный подход для количественной оценки выхода ДНК хозяина с целью прогнозирования риска ошибок и обеспечения критических пороговых значений для ПЦР и репликаций генотипирования [11,23]. Кроме того, были предложены методы обогащения ДНК хозяина из фекалий [33].

Несмотря на эти достижения в молекулярных методах и разнообразие доступных инструментов, существует мало объективной оценки того, как выбирать между отбором проб и лабораторными методами [17], что препятствует распространению новых инструментов для рутинных неинвазивных генетических анализов.Использование мазков для отбора проб фекалий остается анекдотическим в обширной опубликованной литературе по исследованиям природоохранной генетики [26], в то время как количественные ПЦР-анализы были разработаны только для ограниченного числа видов [34]. На сегодняшний день сравнительно немного исследований применяли генотипирование SNP к образцам фекалий [35–39]. Недостаточное использование этих новых методов является одной из причин того, почему неинвазивные генетические подходы постепенно возникают как рутинные инструменты для поддержки управления сохранением и принятия решений [6,40]. Менеджеры по-прежнему неохотно выделяют ресурсы на исследования ДНК фекалий, потому что остается неопределенность в отношении успеха в восстановлении достаточного количества данных хорошего качества, в то время как требуются большие инвестиции в полевые работы и лабораторные затраты [41].Необходима значительная работа по совершенствованию методов сбора и подготовки проб, чтобы повысить точность и успех рутинных неинвазивных исследований ДНК и облегчить их выполнение для сохранения и управления.

В этом документе предлагаются рекомендации по оптимизации качества образцов фекальной ДНК для точного и экономичного генотипирования. Мы провели неинвазивное генетическое исследование с использованием панели маркеров SNP и образцов фекалий исчезающего лесного слона ( Loxodonta cyclotis ), относительно малоизученного вида, где неинвазивные подходы желательны из-за нехватки прямых наблюдений в тропических лесах. среда.Нашей целью было разработать инструменты для всех трех видов слонов, используя следующий подход, который можно применить к нескольким таксонам:

1. Разработка количественного анализа ПЦР;
2. Валидация нового удобного метода отбора проб в полевых условиях с рекомендациями по хранению проб и подходящим протоколом экстракции;
3. Предварительный скрининг набора фекальных проб с использованием количественного анализа ПЦР и определения порога ДНК для точного генотипирования с помощью панели маркеров SNP.

Материалы и методы

Сбор и хранение образцов

Мы провели полевые исследования в период с июня 2014 г. по январь 2015 г. на 26 исследовательских участках в Габоне, Центральная Африка (рис. 1). Габон в основном покрыт тропическими лесами, а 10% земель классифицируются как национальные парки. Продолжительный сезон дождей длится с октября по апрель, с непостоянным коротким сухим сезоном в декабре и январе. Продолжительный сухой сезон длится с мая по сентябрь, хотя внутри страны наблюдаются колебания.Среднемесячное количество осадков составило от 62 до 420 мм. Средние месячные температуры колебались от 28 ° C до 31 ° C, а средняя относительная влажность от 88% до 92%. В Габоне проживает половина оставшейся популяции лесных слонов (~ 50 000 особей) [42], но он сталкивается с беспрецедентным кризисом браконьерства [43]. Участки исследования включали как национальные парки, так и лесные угодья, где, как считается, обитает большое количество слонов.

Рис. 1. Распределение точек отбора проб слонов по всему Габону.

Кружки пропорциональны количеству проб фекалий, собранных на каждом участке отбора проб (общее количество указано выше). Участки отбора проб были сгруппированы в девять участков отбора проб (представленных полигонами).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.g001

Это исследование было проведено Агентством национальных парков Габона (ANPN). Мы получили разрешение на проведение этого исследования от Национального центра научных исследований и технологий (разрешение AR0016 / 14) и Главного управления фауны и защитников мира (сертификат происхождения 005/15).Мы получили разрешения на доступ от лесных концессий, когда это применимо.

Мы провели 1-2 недели полевых исследований на каждом участке исследования для сбора свежих фекалий слонов. Фекалии считались «свежими», если их возраст составлял менее 24 часов, они были защищены от солнечного света лесным покровом и не подвергались сильному дождю. Кучи свежего навоза характеризовались блестящим цветом, в основном неповрежденными навозом (если они не были очень влажными и не были уничтожены насекомыми) и сильным запахом [44]. Другими сильными показателями свежести было присутствие в непосредственной близости мочи, мелких мух и следов слонов.Подмножество свежих фекалий было переклассифицировано как «очень свежие» (т.е. возрастом менее одного часа), когда слона было видно или слышно непосредственно, а куча навоза была теплой.

Чтобы оценить влияние качества навозной кучи на эффективность экстракции ДНК, мы также собрали образцы фекалий, которые имели «уменьшенную поверхность», подходящую для отбора образцов (т. Е. Те, которые классифицируются как возраст менее 24 часов, но частично разрушенные насекомыми или подвергшиеся прямому воздействию солнечного света. ), а также от потенциально «деградированных» куч навоза (т.е. находящиеся в возрасте от 24 до 48 часов и лица любого возраста, обнаруженные после дождя или частично погруженные в воду). Для двух последних категорий протирали только неповрежденную блестящую поверхность.

Образцы фекалий собирали с помощью буккального тампона (Isohelix, Cell projects), предварительно смоченного буфером для хранения (500 мкл LS-буфера и 25 мкл протеиназы K, Stabilizing Kits, Isohelix, Cell Projects). Всю блестящую слизистую поверхность каждого комка, принадлежащего кучке навоза, осторожно протирали тампоном, чтобы нацелить на слизистый слой, покрывающий кучу навоза, и были приняты меры, чтобы избежать скопления фактического фекального материала (рис. 2).Затем кончик тампона защелкивался и погружался в буфер для хранения в маркированной светозащитной пробирке Eppendorf на 2 мл с защитным замком. Образцы хранили при комнатной температуре в темноте от 1 до 4 недель перед отправкой в ​​лабораторию для немедленного извлечения ДНК или хранения при -20 ° C. Для сравнения мы собрали дубликаты образцов из 78 куч навоза, используя другой метод отбора проб и двухэтапный протокол консервации (рис. 2). В этом методе небольшой кусочек фекалий отбирали из внешнего слоя болюса и хранили в 96% этаноле (20 мл) в течение 24 часов при температуре окружающей среды перед переносом в шарики диоксида кремния (30 г) [19].

Рис. 2. Отбор проб из кучи слоновьего навоза с использованием двух методов отбора проб.

Образцы собирали с использованием (A) тампона, хранящегося в буфере для лизиса, в 2-миллилитровой светозащитной пробирке или (B) в соответствии с двухэтапным протоколом, в котором небольшой кусочек фекалий хранится в этаноле в 50-мл пробирке. в течение 24 часов перед переносом в другую пробирку объемом 50 мл с гранулами кремнезема. Тряпочный материал было удобнее и удобнее носить с собой в полевых условиях, и он позволял очищать всю поверхность навозной кучи.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.g002

Извлечение ДНК

Мы использовали протокол набора QIAamp Fast Stool Mini (QIAGEN) для извлечения ДНК из образцов, сохраненных с использованием двухэтапного метода, следуя инструкциям производителя. Мы изменили этот протокол для извлечения ДНК из образцов, взятых тампоном, следующим образом: (i) исходный образец (кончик тампона в буферном растворе) встряхивали и центрифугировали в течение 2 минут (14100 г) перед тем, как выбросить тампон, (ii) 250 мкл К супернатанту добавляли Inhibitex, (iii) образцы инкубировали с протеиназой K в течение 1 часа при 56 ° C, (iv) к образцу добавляли 500 мкл буфера для захвата CT (набор для экстракции Isohelix, Cell Project) (вместо этанола) и (v) ДНК элюировали в 75 мкл буфера ATE (таблица S1).Для каждой партии образцов мы использовали бланки экстракции ДНК для контроля загрязнения. Все экстракты ДНК очищали с использованием наборов для удаления ингибиторов OneStep PCR (исследование Zymo).

Количественное определение ДНК

Концентрация ДНК слона во всех образцах была измерена с помощью количественного анализа ПЦР. Мы разработали праймеры 2804 F (5’CCTGGCAGAGCTCAGCAGAT-3 ‘) и 2804 R (5’GGATGAGGGCCAGAGTGTCC-3’) с использованием Primer3 [45] в Geneious версии 9 [46] для амплификации короткой ядерной последовательности (130 п.н.) трансмембранного белка. Ранее было показано, что ген 184A сохраняется у лесных слонов [47].Мы выбираем длину целевой последовательности, чтобы гарантировать ее пригодность для деградированных образцов и сходство с размером ампликона SNP. Образцы фекальной ДНК из двух содержащихся в неволе африканских саванн ( Loxodonta africana ) и пяти содержащихся в неволе азиатских слонов ( Elephas maximus ) были включены в анализ для проверки эффективности праймеров у этих видов. Мы использовали BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), чтобы подтвердить, что праймеры не амплифицируют ДНК человека.

Семь серийных разведений ДНК, выделенной из образца ткани лесного слона, предоставили стандарты для калибровки абсолютного количественного определения.Серийное разведение варьировалось от 20 до 0,0013 нг / мкл с серийным коэффициентом 5. Четыре самых высоких стандарта (20, 4, 0,8 и 0,16 нг / мкл) хранили при 7 ° C в течение 48 часов для обеспечения гомогенизации и количественно определяли с помощью флуорометрии. (с использованием наборов QuBIT DNA для анализа широкого диапазона и высокой чувствительности, Invitrogen, Thermo Fisher). Три самых низких стандарта были свежеприготовлены перед экспериментом путем серийного разбавления и встряхивания для обеспечения гомогенизации перед последующим разбавлением. Стандарты и отрицательные контроли были включены в дубликаты во все планшеты.Все количественные эксперименты ПЦР проводились в течение четырех дней, чтобы минимизировать разброс стандартов между планшетами, и два положительных контроля были повторены на планшетах для проверки вариабельности. Подмножество образцов фекалий было повторно проанализировано в парах образцов со мазками с дублированными образцами двухступенчатого консервирования в течение двухдневного периода со свежими стандартами. Кроме того, мы количественно оценили подмножество из 27 образцов с помощью флуорометрии (с использованием наборов QuBIT DNA Broad Range и High Sensitivity Assay, Invitrogen, Thermo Fisher), чтобы сравнить общий выход ДНК и выход ДНК слона.

Количественные реакции ПЦР в реальном времени проводили в 10 мкл реакций, содержащих 1 мкл ДНК, 5 мкл основной смеси SYBR Green I, 1 мкл эталонного красителя QN ROX (QuantiNova SYBR Green PCR Kit, Qiagen) и 0,7 мкл каждого праймера. (10 мкМ). Для разбавления ингибиторов [38] образцы фекалий перед экспериментом разбавляли бидистиллированной водой в соотношении 1: 20. Количественные реакции ПЦР проводили в системе для ПЦР в реальном времени StepOne (Applied Biosystems) с начальной стадией выдержки 2 мин при 95 ° C, с последующими 40 циклами при 95 ° C в течение 5 с, 60 ° C в течение 10 с и конечная стадия кривой плавления постепенно увеличивается от 60 до 95 ° C в течение 15 минут.Стандартные кривые использовали для расчета концентрации ДНК слона в образцах, разбавленных в 20 раз [11]. Преобразованную концентрацию чистых экстрактов ДНК использовали для дальнейших анализов, если не указано иное. Была исследована эффективность стандартных кривых (коэффициент корреляции r ² ) и профилей кривой плавления. Любой стандарт или образец, генерирующий неспецифическую амплификацию (т.е. продукты ПЦР, плавящиеся при температурах выше или ниже желаемого продукта 84,7 ° C), исключались из анализа.

Генотипирование

Для оценки успеха генотипирования образцы были отправлены в LGC Genomics для генотипирования SNP с использованием 107 тестов KASP, разработанных и проверенных для лесных слонов [47]. Пилотное исследование было выполнено с использованием четырех анализов SNP (CL_370, CL_406, CL_2831 и CL_2968) и нескольких разведений (5, 10, 20, 40) поднабора из 88 образцов, выбранных в широком диапазоне концентраций (от 0 до 12,2 нг / мкл). ). Чтобы определить оптимальное разведение, мы классифицировали образцы на четыре категории в зависимости от концентрации целевой ДНК: [0–0.01), [0,01–0,1), [0,1–0,6) и ≥ 0,6 нг / мкл. Мы оценили средний успех генотипирования в четырех локусах при каждом факторе разведения для всех категорий. На основании этого предварительного тестирования было проведено дальнейшее генотипирование с использованием 10-кратных разведений всех образцов фекалий, и все образцы, дающие концентрацию выше 0,01 нг / мкл, были отобраны для генотипирования (S1 Рис.). Чтобы проверить, предсказывает ли концентрация ДНК слона успех генотипирования, для генотипирования также была отобрана случайная подгруппа образцов с очень низким выходом ДНК (0–0,01 нг / мкл).Оценка генотипа проводилась с помощью автоматического определения аллелей (LGC Genomics). Для контроля качества в каждый 96-луночный планшет были включены два отрицательных контроля, и 14 образцов были воспроизведены два или три раза в разных планшетах. Мы оценили частоту аллельных ошибок напрямую как долю выпадающих аллелей и ложных аллелей в пределах положительного контроля.

Анализ данных

Мы оценили успех экстракции как долю образцов с детектируемым выходом ДНК слона, используя количественный анализ ПЦР, и успех генотипирования на образец как долю локусов, для которых был назначен однозначный генотип.Используя набор из 78 дублированных образцов навоза, мы сравнили концентрации ДНК слонов в образцах, собранных с помощью мазка и двухэтапных протоколов с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни-Уилкоксона. Мы также оценили статистические различия между двумя методами отбора проб в разных группах качества фекалий.

Мы использовали обобщенные линейные смешанные модели, чтобы проверить влияние времени хранения и качества фекалий как независимых переменных-предикторов на концентрацию ДНК слона. Поскольку частотный график предполагал нулевую инфляцию (S2 рис.), Мы использовали модель, состоящую из двух частей, чтобы исследовать влияние времени и качества хранения на присутствие и концентрацию ДНК [48].В первой части мы использовали биномиальное распределение для моделирования вероятности того, что наблюдается нулевое значение, и мы использовали модель для прогнозирования успеха экстракции в зависимости от времени хранения для ДНК различного качества. Во второй части мы применили усеченное отрицательное биномиальное распределение к ненулевым данным, чтобы учесть чрезмерную дисперсию, и мы использовали модель, чтобы проверить влияние времени хранения и качества фекалий на концентрацию ДНК слона.

Переменной ответа было абсолютное значение концентрации ДНК слона в пг / мкл.Типы качества включали «очень свежие», «свежие», «с уменьшенной поверхностью» и «деградированные» фекалии. В качестве эталонной категории использовалось свежее качество. Мы использовали время хранения (в неделях) как непрерывную переменную (стандартизованную). Мы также включили в модель взаимодействие между временем хранения и качеством, чтобы проверить, зависит ли влияние времени хранения от качества фекалий. Время хранения сильно коррелировало с сезоном из-за логистических ограничений, поэтому мы исключили последнее из модели. Участки исследования были сгруппированы в девять участков, когда они были близки (рис. 1) и посещались в одно и то же время года.Все образцы из одного места были собраны, доставлены в лабораторию и извлечены одновременно как партия. Поэтому, чтобы исправить отсутствие независимости между образцами, собранными в одном и том же месте, и учесть другие возможные эффекты (например, погоду, диету, тип среды обитания, условия транспортировки), мы рассмотрели место отбора образцов как случайный эффект. Мы использовали информационный критерий Акаике (AIC) для сравнения моделей-кандидатов и выбора минимально адекватной модели [49].

Мы использовали квазибиномиальные обобщенные линейные модели для изучения влияния концентрации целевой ДНК на успех генотипирования для различных панелей из 15, 50 и всех 107 SNP и определения пороговых значений концентрации для генотипирования.Концентрации ДНК были преобразованы логарифмически для статистического анализа. Панели из 15 и 50 SNP были отобраны на основе наивысшего успеха генотипирования на локус. Все анализы проводились с использованием R версии 3.3.1 [50], с использованием пакетов lme4 [51] и glmmADMB [52,53].

Результаты

Всего было отобрано 572 пробы фекалий, в том числе 458 проб свежего навоза, с использованием техники смыва. Среднее время хранения между сбором образца и экстракцией ДНК составляло 7,6 недель (диапазон: 0,7–18,9).После количественной ПЦР все стандартные кривые показали хорошую точность (r ² > 0,95). Все три вида слонов успешно амплифицировались с использованием праймеров 2804, демонстрирующих консервативную природу этого фрагмента. Концентрации фекальной ДНК для свежих образцов мазков варьировались от 0,0 до 26,99 нг / мкл (среднее значение = 0,97 нг / мкл, n = 458). Отношение эндогенной ДНК к общей варьировало от 0,001 до 29,5% (среднее значение = 2,93%, n = 27). Общий успех экстракции свежих образцов составил 65,9% (n = 458). Он вырос до 74.5% (n = 47) для очень свежих образцов, собранных в течение одного часа после дефекации, и 84,7% (n = 261) для свежих образцов, взятых в течение 8 недель. После экстракции ДНК 76 элюатов ДНК приобрели коричневый цвет, и отсутствие количественных реакций ПЦР указывало на присутствие ингибиторов. Эти образцы были исключены из дальнейших анализов. В общей сложности 382 образца дали целевую концентрацию ДНК слона выше 0,01 нг / мкл и были генотипированы по всем локусам SNP, вместе с 121 образцом, которые не достигли этого порога.После генотипирования по 107 локусам частота ошибок составила 0,0029.

Сравнение методов отбора проб

Концентрация ДНК слона в образцах, взятых тампоном, была в 42,9 раза выше, чем в образцах, консервированных кремнеземом, и разница была статистически значимой (V = 1631, p <0,001) (Таблица 1). Более высокая концентрация целевой ДНК была также получена с помощью техники мазка во всех категориях фекального качества (p <0,05). Средняя концентрация составляла от 29,5 (<1 часа) до 505.В 4 (> 24 часа) раза больше в образцах, подвергнутых мазку, чем в образцах, законсервированных силикагелем. Максимальная концентрация ДНК слона, полученная из образцов, консервированных с использованием двухэтапного метода, составила всего 0,47 нг / мкл, и только 5 образцов достигли порогового значения концентрации ДНК 0,01 нг / мкл (рис. 3).

Таблица 1. Результаты теста Манна-Уитни-Уилкоксона по средней концентрации ДНК слона (нг / мкл) между двумя методами отбора проб ДНК фекалий.

Результаты основаны на 79 образцах фекалий, взятых в двух экземплярах с использованием мазка или двухэтапного протокола.Образцы были разделены на четыре категории в зависимости от качества фекалий: очень свежие, свежие, с уменьшенной поверхностью и деградированные.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.t001

Влияние времени хранения на концентрацию целевой ДНК

В биномиальной модели, объясняющей присутствие ДНК, две лучшие модели, основанные на AIC, включали только время хранения или как время хранения, так и эффекты качества (ΔAIC <2). Член взаимодействия существенно не улучшил модель (ΔAIC = -2.1) (таблица 2). Мы использовали модель со временем хранения и качеством для моделирования присутствия ДНК, потому что она имела самый низкий AIC, а категория «деградированная» значительно отличалась (p <0,05) (таблица 3). Время хранения пробы фекалий оказало значительное влияние на вероятность присутствия ДНК в экстракте (p <0,001) (Таблица 3). Вероятность выделения ДНК в кучах деградированного навоза была в 2,13 раза ниже, чем в кучах свежего навоза (p <0,05). Разница между очень свежими, свежими фекалиями и фекалиями с уменьшенной поверхностью не была значительной.Случайные эффекты объяснили 14,1% дисперсии. Успех экстракции был на 11,3% и на 12,3% ниже в пробах, собранных в двух местах (Южный и Береговой) (S3 Рис.). Модель предсказывала, что успех экстракции снизился до 75% после 9,5 недель хранения. Прогнозируемый успех упал до 50% после 19,5 недель хранения для образцов, собранных из свежих фекалий, против 12,6 недель для разложившихся фекалий и> 6 месяцев для очень свежих фекалий (рис. 4). Прогноз хорошо соответствовал наблюдаемым данным, за исключением партии из 47 образцов с побережья, для которых успех был только 31.9% (S4 рис.).

Рис. 4. Прогнозируемая вероятность извлечения ДНК слона из фекалий за неделю хранения для различных фекалий.

Категории качества фекалий включали: очень свежие (собранные в течение 1 часа после дефекации), свежие (собранные в течение 24 часов после дефекации), с уменьшенной поверхностью (возраст менее 24 часов, но частично разрушенный насекомыми или подвергшийся прямому воздействию солнечного света) и разложившийся (собраны между 24 и 48 часами после дефекации, обнаружены после дождя или частично погружены в воду).Подробная информация о модели приведена в таблице 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.g004

Таблица 2. Сравнение возможных биномиальных моделей для прогнозирования присутствия ДНК слона в образцах фекалий.

Переменными являются время хранения (t) (стандартизовано) и качество фекалий, разделенных на четыре группы: очень свежие (Qvf), свежие (контрольная категория), с уменьшенной поверхностью (Qs), деградированные (Qd).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.t002

Таблица 3. Резюме лучшей биномиальной обобщенной линейной смешанной модели для влияния времени хранения и качества фекалий на успех экстракции ДНК слона.

Качество фекалий 496 экстрактов фекальной ДНК было разделено на четыре группы: очень свежие, свежие (контрольная категория), с уменьшенной поверхностью и деградированные. Местоположение выборки было включено как случайный эффект.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.t003

В модели, содержащей данные выше нуля, модель с самым низким AIC показала, что на концентрацию ДНК слона влияют время хранения, качество фекалий и эффект взаимодействия между двумя переменными (таблица 4).Результаты были менее сильными, чем биномиальная модель из-за небольшого размера выборки по трем категориям качества и шума, но подтвердили аналогичные закономерности с первой частью модели (результаты представлены в Приложении S1).

Таблица 4. Сравнение кандидатов усеченных отрицательных биномиальных моделей для прогнозирования концентрации ДНК слона в образцах фекалий.

Переменными являются время хранения (t) (стандартизовано) и качество фекалий, разделенных на четыре группы: очень свежие (Qvf), свежие (контрольная категория), с уменьшенной поверхностью (Qs), деградированные (Qd).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.t004

Влияние концентрации ДНК на успех генотипирования

Успех генотипирования достоверно коррелировал с концентрацией ДНК слона (p <0,001) (рис. 5A). Модель предсказывала, что концентрация 4,65 нг / мкл (698 нг на реакцию) приводит к 80% успеху генотипирования с панелью всех 107 SNP. Пороги целевой концентрации были ниже для небольших панелей SNP (рис. 5B). Минимальные концентрации 0.285 и 0,115 нг / мкл (42,8 и 17,3 пг ДНК на реакцию) требовались для достижения успеха генотипирования 80% с панелью из 40 и 15 SNP соответственно. Наш порог 0,010 нг / мкл (1,5 пг на реакцию) привел к 49,3% успеху генотипирования с панелью из 15 SNP.

Рис. 5. Взаимосвязь между успехом генотипирования с использованием различных панелей SNP и концентрацией ДНК слона.

(A) Связь между успехом генотипирования по 107 локусам SNP и концентрацией ДНК слона, измеренной с помощью количественного анализа ПЦР в реальном времени, была установлена ​​с использованием набора данных из 521 экстракта фекальной ДНК (обозначено точками).(B) Это соотношение сравнивалось с меньшими панелями из 15 и 40 SNP. Генотипирование проводили для каждого локуса с использованием 1,5 мкл экстрактов ДНК в разведении 1:10.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.g005

Обсуждение

Несмотря на потребность в неинвазивных инструментах для мониторинга популяций диких животных, отбор генетических проб фекалий обычно не используется в качестве инструмента управления дикой природой, в основном из-за связанных с этим технических проблем и стоимости. Оптимизация требуется на всех этапах, от сбора образцов до подготовки ДНК для генотипирования, чтобы повысить рентабельность и качество набора данных.В этом исследовании мы собрали обширный набор образцов фекалий лесных слонов и оценили их пригодность для генетического анализа. С помощью недавно разработанного количественного анализа мы продемонстрировали эффективность новых протоколов отбора проб и экстракции у слонов. Как и ожидалось, количественный анализ ПЦР в реальном времени позволил нам предсказать успех генотипирования и провести предварительный скрининг образцов ДНК.

Оптимизация протоколов полевого отбора проб

Выбор метода отбора проб и носителя данных имеет решающее значение для последующего успеха генотипирования.Наши результаты показывают, что мазок с поверхности навоза с последующим хранением в буфере для лизиса был эффективным методом отбора проб, что согласуется с предыдущими исследованиями других видов [24,54,55]. Несмотря на эти многообещающие результаты и их удобство в полевых условиях, мазки относительно мало использовались при отборе генетических проб фекалий диких животных [23,26]. Насколько нам известно, это исследование является первым, в котором сообщается об использовании мазков для отбора проб фекалий у слонов, и наблюдаемый успех экстракции ДНК для образцов, собранных в течение 24 часов после дефекации, был высоким (85% в течение 8 недель хранения).Это выше, чем сообщалось в других исследованиях лесных слонов, где от 60 до 80% образцов фекалий, хранящихся в этаноле или в буфере королевского колледжа, рекомендованном программой CITES MIKE (мониторинг незаконного убийства слонов) [56], были успешно используется для микросателлитного генотипирования [9,44,57–59].

Мы обнаружили, что выход целевой ДНК был более чем в 40 раз выше в образцах мазков по сравнению с образцами, сохраненными с использованием двухэтапного метода, независимо от качества фекалий. Исходя из концентрации ДНК слона, мы бы отбросили 79.5% проб отобраны двухэтапным методом перед генотипированием. Только в двух других исследованиях было проведено прямое сравнение тампонов с другими методами отбора проб. Подобно нашим результатам, у непарнокопытных успех генотипирования был почти нулевым при двухэтапном методе и почти 100% при использовании мазков [17]. Сообщалось о более высоком выходе целевой ДНК с мазками по сравнению с хранением этанола у некоторых видов, особенно у травоядных [26].

Высокая эффективность метода взятия мазков, продемонстрированная в нашем исследовании, может быть объяснена техникой отбора образцов.Мы использовали тампон, чтобы очистить всю поверхность навоза, таким образом, получая больше ДНК на образец, чем методы, нацеленные на небольшой кусок внешнего слоя навоза. Это особенно верно для видов с большими пометами или многочисленными гранулами, обеспечивающими большую площадь поверхности [60]. Кроме того, наши результаты продемонстрировали эффективность метода мазка для нацеливания на клетки-хозяева, поскольку доля эндогенной ДНК была высокой по сравнению со значениями, полученными в других исследованиях с использованием образцов фекалий, собранных с помощью других методов [26,61].Мазки нацелены на отторженные кишечные эпителиальные клетки на поверхности помета более конкретно, чем другие методы сбора, тем самым сокращая одновременный сбор пищи или микробного материала [54]. Относительно низкая доля эндогенной ДНК в нашем исследовании (до 29,5%) по сравнению со значениями около 50%, указанными в образцах мазков в другом исследовании [26], может быть ограничена более высокой концентрацией микроорганизмов на поверхности помета в тропических условиях. среда.

Выбор куч навоза, подходящих для отбора проб, — еще один важный шаг, определяющий успех сбора проб.Мы обнаружили, что на успех экстракции образцов мазков влияла свежесть навозной кучи и воздействие различных факторов окружающей среды, включая УФ-свет, влажность, а также неизмеряемые факторы, такие как температура и наличие микроорганизмов, как и ожидалось в предыдущих исследованиях [13,16, 62,63]. Мы показали, что свежесть оказывает большое влияние на концентрацию ДНК слона и, следовательно, качество образцов для исследований ДНК было оптимальным в течение одного часа после дефекации. Это противоречило предыдущим открытиям на выдре ( Lutra lutra ), где не было обнаружено никаких изменений в течение 20 часов после дефекации [54], но, вероятно, из-за тропической среды, поскольку разложение происходит быстрее, чем в сухой или очень холодной среде [13 ].В нашем исследовании успех экстракции снизился из-за влажной среды (осадки или частичное погружение в воду) и возраста образца навоза, превышающего 24 часа, что также было зарегистрировано у тигров ( Panthera tigris ) [64]. Напротив, воздействие прямых солнечных лучей значительно снижает концентрацию ДНК, но не снижает ее присутствие, и эти образцы подходят для генотипирования. Этот результат можно объяснить нашей техникой отбора проб, поскольку мы протирали мазками только те стороны навоза, которые были затемнены от прямого УФ-излучения.

В нашем исследовании различия между местоположениями и людьми также частично объясняют вариабельность обеих моделей присутствия и концентрации ДНК. Эти различия можно объяснить вариациями в диете, которые известны как фактор, влияющий на успех генотипирования [14]. Предыдущие исследования показали, что качество диеты влияет на время пищеварения и, следовательно, на истирание кишечных клеток, содержащих ДНК хозяина [65], и что некоторые растения или фрукты содержат ингибиторы ПЦР [66,67]. В нашем исследовании виды плодов и доля травы в фекалиях слонов варьировались в зависимости от места отбора проб и сезона (S.Буржуй, личное наблюдение). Необходимы дополнительные исследования, чтобы помочь выбрать кучу навоза, наиболее подходящую для исследований ДНК на основе диеты слона.

Основным результатом нашего исследования является сокращение затрат и усилий на создание высококачественного набора генетических данных по фекалиям. Свабирующий материал был более удобным и легким в переноске, занимая минимум места в полевых условиях, что позволяло собирать больше образцов за одну поездку, что на 50% сокращало количество человеко-дней в удаленных районах. Это сильные преимущества для удаленных и труднодоступных полевых участков, таких как тропические леса.Кроме того, высокий успех экстракции снижает целевое количество проб навоза, обычно необходимое для компенсации аналитических сбоев [5], что дополнительно снижает полевые затраты и усилия примерно на 15%. У видов с низкой плотностью и / или ежедневной дефекацией снижение затрат на полевые работы может быть ограничено трудностью поиска свежих образцов навоза (<24 часов). Кроме того, возраст навозных куч может быть трудно оценить в полевых условиях [68]. У этих видов может потребоваться сбор более старых образцов навоза, чтобы увеличить количество собранных образцов, даже если это приводит к увеличению лабораторных затрат из-за снижения скорости извлечения.Пилотное исследование, включающее образцы навоза разного возраста, позволило бы установить разумные пороговые значения возраста навоза для этих видов в качестве баланса между лабораторными затратами и полевыми усилиями.

В лаборатории экстракция ДНК из образцов мазков была быстрой и простой, так как пробирку просто встряхивали в течение 10 секунд и центрифугировали в течение 2 минут перед тем, как тампон выбрасывали. Напротив, выделение ДНК из образцов, собранных с использованием двухэтапного протокола, занимало много времени и сопряжено с более высоким риском заражения из-за необходимости соскоблить или выбрать кусок фекалий перед экстракцией.Количество образцов мазков, которые можно было взять в день на человека, составило 48 с образцами мазков по сравнению с 16 при двухэтапном протоколе, что на 66% снижает затраты на рабочую силу. Это было похоже на результаты предыдущего исследования, показавшего, что выделение ДНК из мазков связано с более быстрым временем обработки и позволяет работать с партиями большего размера [69].

Отмеченные преимущества отбора проб свежего фекального материала с точки зрения успеха лаборатории также следует учитывать в связи с повышенными усилиями по поиску достаточного количества проб этого типа, в отличие от более мягких критериев для сбора фекального материала в любых условиях.Всегда существует компромисс с точки зрения стоимости проекта между сбором проб и лабораторным анализом. Лабораторный анализ проще, быстрее и дешевле при использовании надежных источников образцов ДНК, но, хотя это приводит к предпочтению инвазивных типов образцов перед неинвазивными образцами и свежего неинвазивного фекального материала по сравнению с более старым материалом, эффективность лаборатории благодаря высокому качеству образцов может быть компенсировано повышенными полевыми расходами. Однако у этого компромисса есть жесткие границы. Так же, как считается совершенно непрактичным (с финансовой и этической точки зрения) усыпить диких лесных слонов, чтобы получить образец ДНК наилучшего качества, просто невозможно выполнить анализ ДНК на образцах, в которых ДНК полностью разрушена.По мере приближения к этому моменту стоимость анализа ДНК возрастает, но также, что важно, качество получаемых генетических данных и их полезность для биологических выводов снижаются. Этот вопрос качества данных часто упускается из виду из-за простого компромисса между лабораторными и полевыми расходами. Поэтому мы утверждаем, что более высокие усилия по поиску свежих образцов в полевых условиях на самом деле являются требованием, а не сбалансированным выбором, если альтернативой является сбор образцов, которые не только очень дороги для обработки в лаборатории, но и только дают данные предельной биологической ценности.Важно, чтобы этот вопрос широко понимался для улучшения планирования полевых работ и управления ожиданиями менеджеров по охране дикой природы и доноров, когда они приступают к реализации генетических проектов по сохранению.

Оптимизация пробоподготовки

Мы подчеркнули важность подготовки образцов, включая хранение образцов фекалий перед экстракцией ДНК и разбавление образцов ДНК перед генотипированием, исследуя влияние времени хранения и степени разбавления на успех генотипирования. Мы показали, что время хранения отрицательно влияет на успех экстракции ДНК, и использовали это соотношение, чтобы дать рекомендации по максимальному времени хранения.Концентрация ДНК слона также снижалась с увеличением времени хранения, даже если образцы сильно различались. Прогнозируемый успех выделения фекальной ДНК снизился до уровня ниже 75% через два месяца и до 50% через пять месяцев. Этот результат был аналогичен другим исследованиям, которые показывают значительное снижение успешности генотипирования после одного-трех месяцев хранения независимо от носителя [20,70]. Показатели успешности ПЦР 75% были получены для экстрактов ДНК, хранящихся до четырех месяцев, и 50% для экстрактов, хранящихся более шести месяцев, когда образцы навоза отбирались в течение 1 часа после осаждения.Это подчеркивает важность выбора как можно более свежего навоза, хотя, по общему признанию, это не всегда практично для неуловимых видов. Некоторые авторы предлагают удалить ватный тампон для длительного хранения [55]. Хранение образцов при более низкой температуре, например -80 ° C, также может замедлить деградацию ДНК. Однако мы считаем, что короткое время хранения является ключевым фактором успеха генетических исследований.

Тщательное планирование лабораторных анализов перед проведением полевых работ имеет первостепенное значение для ограничения времени хранения и повышения успешности экстракции ДНК.Создание внутри страны потенциала для извлечения ДНК в стране-источнике позволит обрабатывать образцы по мере их сбора, что особенно важно в исследованиях, предполагающих длительный период полевых исследований, когда регулярный экспорт образцов нецелесообразен. Необходимые вложения в базовое оборудование и обучение разумны. Лаборатория экстракции ДНК может быть размещена в одном помещении, оборудованном стендом, набором пипеток, центрифугой, инкубатором, вортексом и морозильной камерой (общая стоимость <6000 долларов США) и готовыми наборами для выделения ДНК.Обучение лаборанта извлечению ДНК возможно в течение пары недель.

Помимо низкого успеха экстракции, приводящего к отсутствию или недостаточному выходу целевой ДНК, присутствие ингибиторов является второй наиболее частой причиной неудач амплификации в образцах фекалий в утвержденных условиях ПЦР [3]. Наше исследование подчеркнуло необходимость проведения пилотного исследования для определения оптимального разведения перед генотипированием. Пилотное исследование показало, что 10-кратное разведение увеличивает успех генотипирования, что было аналогично предыдущему исследованию на азиатских слонах [38].Оптимальное разведение представляет собой компромисс между подходящим разбавлением ингибиторов в образцах с высоким выходом ДНК при минимальном риске разведения ДНК в образцах с низким выходом ДНК. Однако в нашем исследовании значительная часть элюатов ДНК (14,5%) имела коричневый цвет, который часто связан с присутствием ингибиторов, таких как гуминовые примеси [71]. Эти образцы нельзя было количественно определить с помощью ПЦР-анализа при любой степени разбавления. Поскольку происхождение этих образцов было сосредоточено в 5 участках (2 участка в устье, 1 участок вдоль побережья, Лопе и озера), мы полагаем, что это было связано с различиями в рационе, а не с методом отбора проб.Было обнаружено, что метод мазка минимизирует количество ингибиторов ПЦР [26]. Дальнейшие исследования должны быть направлены на улучшение протоколов экстракции, в частности этапов очистки, чтобы оптимизировать удаление ингибиторов [72].

Предварительный скрининг образцов ДНК перед генотипированием

Мы обнаружили, что, несмотря на оптимизированные протоколы сбора, хранения и извлечения образцов, качество и количество ДНК, извлеченной из куч навоза, сильно различались в разных образцах. Следовательно, предварительная оценка образцов была необходима для повышения общего успеха генотипирования и снижения риска ошибок.Выход целевой ДНК был хорошим предиктором успеха генотипирования, как показано в предыдущих исследованиях [11,22,73,74]. Когда вид происхождения трудно подтвердить визуальным осмотром помета (например, у плотоядных животных), требуется предварительная идентификация вида, часто включающая секвенирование митохондриальной ДНК [16,60]. Двухэтапный подход, начинающийся с секвенирования митохондриальной ДНК для информирования о последующем выборе подходящего количественного ПЦР-анализа для конкретных видов, может быть экономически эффективным методом предварительного скрининга образцов на основе концентрации.Это потребует тщательного тестирования специфичности праймеров, чтобы убедиться, что они не амплифицируют ДНК родственных видов [75,76]. В качестве альтернативы, одноэтапный вариант мог бы заключаться в дифференциации между несколькими видами (например, плотоядными) путем комбинирования праймеров ПЦР, типичных для хищников, с анализом кривой плавления, дискриминационным по видам, в одном анализе qPCR.

Путем моделирования двух различных сокращенных панелей из 15 и 40 SNP с использованием локусов высокого качества и количества локусов, обычно используемых для индивидуальной идентификации или анализа отцовства [77,78], мы показали, что взаимосвязь между концентрацией целевой ДНК и успехом генотипирования варьировалась в зависимости от количества маркеры и отдельные локусы.Наш подход был консервативным, так как мы не пересчитывали график генотипа вручную. Это увеличило бы успех генотипирования, потому что автоматический вызов аллеля приводит к высокой доле неназначенных вызовов генотипа [79]. Несмотря на это, мы обнаружили, что для достижения 80% успеха генотипирования требовалось очень небольшое количество ДНК на реакцию (22,5 или 45 пг ДНК на реакцию с панелью из 15 или 40 SNP соответственно). Эти значения были ниже пороговых значений, указанных для микросателлитного и SNP-генотипирования (50–200 пг на реакцию) в предыдущих исследованиях [11,22,60,80].Различия в пороговых значениях между исследованиями объясняются различиями в типах маркеров [73], выбором метода генотипирования [35] и представляющими интерес видами [74]. Как следствие, пороговые значения для категоризации выборки необходимо устанавливать в каждом конкретном случае для каждого вида и набора маркеров. Наше исследование еще раз подчеркнуло необходимость проведения пилотного исследования [10,34] для установления разумных пороговых значений. Пилотное исследование также позволит оценить долю образцов плохого качества и решить, следует ли их отбрасывать или генотипировать в повторностях, как баланс между затратами и необходимостью выбора подходящего размера.

Использование количественной ПЦР долгое время ограничивалось стоимостью оборудования и реагентов [34], но теперь этот метод стал доступным [23]. Отказ от образцов, которые вряд ли дадут жизнеспособные результаты до генотипирования, снижает затраты на генотипирование и риск ошибок. Количественная оценка ДНК (реагенты и планшеты) стоит примерно 1 доллар США за образец, не считая затрат на рабочую силу, и позволила нам снизить общие затраты на генотипирование более чем на треть. Необходимость в предварительном отборе проб еще выше у видов, у которых возраст навозных куч трудно оценить в полевых условиях [68], что приводит к увеличению доли неподходящих проб.В других исследованиях до 50–60% неинвазивных образцов было отбраковано на основании количественной оценки целевой ДНК [74,81,82]. Снижение затрат еще больше по сравнению с подходом с несколькими пробирками, который пропагандируется для микросателлитных исследований [10], где рекомендуемые 7 повторений для гомозиготных локусов часто являются чрезмерно дорогими. Например, количественный анализ ПЦР был использован для уменьшения количества повторений, необходимых для точного генотипирования, до 2 для образцов, превышающих пороговые значения количества ДНК [11].Мы считаем, что разработка и использование анализов количественной оценки для конкретных видов значительно повысит рентабельность исследований ДНК в фекалиях.

Выводы

Мы продемонстрировали эффективность наших инструментов в создании набора данных фекальной ДНК хорошего качества у слонов. Поэтому мы рекомендуем собирать образцы фекальной ДНК в течение 24 часов после дефекации у слонов, используя тампон, сохраненный в буфере для лизиса. Экстракцию ДНК следует проводить как можно скорее после сбора или в течение двух месяцев, чтобы гарантировать успех экстракции на 75%.Использование количественного анализа ПЦР, который был проверен на всех трех видах слонов, для предварительного скрининга образцов ДНК имеет важное значение для снижения стоимости генотипирования.

Тот же подход может использоваться менеджерами для повышения рентабельности рутинных исследований ДНК фекалий у самых разных видов. Чтобы оптимизировать качество образцов фекальной ДНК из полевых условий в лабораторию для точного и экономичного генотипирования, мы рекомендуем:

1. Подтвердите эффективную и удобную технику отбора проб для интересующих видов и окружающей среды.Мы настоятельно рекомендуем протестировать технику взятия мазков и ожидаем, что ее использование будет расти в будущих исследованиях слонов и других видов животных;
2. Выполняйте экстракцию ДНК как можно скорее после взятия образца, чтобы обеспечить соответствующий выход ДНК. Во многих случаях развитие потенциала внутри страны по выделению ДНК может способствовать сокращению времени хранения;
3. Провести пилотное исследование для оценки оптимального разведения для минимизации эффектов ингибиторов и определения порога успешного и точного генотипирования с использованием выбранного набора маркеров;
4. Определите количество целевой ДНК во всех образцах и удалите образцы низкого качества перед генотипированием.

Мы считаем, что этот подход поможет менеджерам широко охватить исследования ДНК фекалий и будет способствовать сдвигу в области геномики с использованием ДНК фекалий.

Вспомогательная информация

S1 Таблица. Модифицированный протокол выделения ДНК из образцов фекалий, собранных с помощью тампона.

Фекалии были очищены с помощью щечного тампона (Isohelix, Cell projects) и сохранены в буфере для хранения (500 мкл LS-буфера и 25 мкл протеиназы K, Stabilizing kit, Isohelix, Cell Projects).Протокол основан на протоколе набора QIAamp Fast Stool Mini (51604) (QIAGEN) и протокола набора Isohelix DNA Isolation (DDK-50) (Cell Project).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.s001

(DOCX)

S2 Рис. Распределение концентрации ДНК слона в 496 образцах фекалий, собранных с помощью тампона.

Концентрации ДНК варьировались от 0 до 28,0 нг / мкл. Образцы сохраняли в буфере для лизиса, и объем элюирования для всех образцов составлял 75 мкл.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.s004

(TIFF)

S3 Рис. Коэффициенты случайных эффектов для 9 точек выборки в двухчастной модели.

Модель включала (A) лучшую биномиальную обобщенную линейную смешанную модель для влияния времени хранения и качества фекалий на успех экстракции ДНК слона и (B) лучшую усеченную отрицательную биномиальную обобщенную линейную смешанную модель для эффектов времени хранения и качество фекалий на концентрацию ДНК слона.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.s005

(TIFF)

S4 Рис. Наблюдаемая и прогнозируемая вероятность извлечения ДНК слона из фекалий за неделю хранения для различных фекалий.

Четыре категории качества фекалий: (A) очень свежие (собранные в течение 1 часа после дефекации), (B) свежие (собранные в течение 24 часов после дефекации), (C) уменьшенная поверхность (возраст менее 24 часов, но частично). уничтожается насекомыми или подвергается воздействию прямых солнечных лучей), и (D) разлагается (собирается между 24 и 48 часами после дефекации, обнаруживается после дождя или частично погружается в воду).Наблюдаемые данные представлены кружками, пропорциональными количеству собранных проб, и окрашены в соответствии с коэффициентами случайного эффекта для мест отбора проб. Детали биномиальной обобщенной линейной смешанной модели приведены в таблице 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.s006

(TIFF)

S1 Приложение. Влияние времени хранения и качества фекалий на концентрацию ДНК слона.

(A) Средняя концентрация ДНК слона (± стандартное отклонение) и (B) прогнозируемая концентрация ДНК слона за неделю хранения для четырех категорий качества фекалий.(C) Резюме лучшей усеченной отрицательной биномиальной обобщенной линейной смешанной модели с использованием 396 экстрактов фекальной ДНК. Качество фекалий было разделено на четыре группы: очень свежие, свежие (контрольная категория), с уменьшенной поверхностью и деградированные. Местоположение выборки было включено как случайный эффект.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210811.s007

(DOCX)

Благодарности

Мы благодарим Национальный центр научных исследований и технологий (CENAREST; разрешение № AR0016 / 14 / MESRS / CENAREST / CG / CST / CSAR) за разрешение на проведение этого исследования в Габоне, а также Главное управление Фаун и др. des Aires Protégées (DGFAP) за выдачу образца разрешения на экспорт СИТЕС (№ 0216).Мы благодарим Agence Nationale des Parcs Nationaux (ANPN), в частности L. J. T. White, и Institut de Recherche en Ecologie Tropicale CENAREST за проведение исследования и предоставление институциональной и материально-технической поддержки. Мы особенно благодарны полевому персоналу ANPN (всем смотрителям и смотрителям парка), в частности Ж.-П. Монджо за помощь в полевых условиях. Концессии лесного хозяйства (SEEF, Rougier, CEB, Toujours Vert, Foreex), OELO, SFM, WCS, SEGC и PPG оказали логистическую поддержку. С.Орбелл и Л. Макага собрали дополнительные образцы. Мы благодарны доктору К. Уитхавону из отдела криминалистики дикой природы Департамента национальных парков, дикой природы и охраны растений Таиланда за помощь в анализе образцов азиатских слонов. Мы благодарим сафари-парк Уэст-Мидлендс за предоставленные образцы слонов саванны, собранные в ходе регулярного мониторинга здоровья. Мы благодарны М. Сиго и Дж. Кьюсаку за полезные комментарии и вклад в рукопись. Средства на проект были предоставлены CEEAC в рамках программы ECOFAC V (Хрупкие экосистемы Центральной Африки), финансируемой Европейским Союзом (контракт № FED / 2013 / 332-349).

Ссылки

1. 1.
   Höss M, Kohn M, Pääbo S, Knauer F, Schröder W. Анализ экскрементов с помощью ПЦР. Природа. 1992; 359: 199. pmid: 1528260
2. 2.
   Морин П.А., Мур Дж. Дж., Чакраборти Р., Джин Л., Гудолл Дж., Вудрафф Д. С.. Родственный отбор, социальная структура, поток генов и эволюция шимпанзе. Наука. 1994; 265: 1193–1193. pmid: 7915048
3. 3.
   Кон MH, Уэйн РК. Пересмотренные факты из фекалий. Trends Ecol Evol. 1997; 12: 223–227. pmid: 21238046
4. 4.Уэйтс Л.П., Паеткау Д. Неинвазивные инструменты отбора генетических образцов для биологов дикой природы: обзор приложений и рекомендации по сбору точных данных. J Wildl Manag. 2005; 69: 1419–1433.
5. 5.
   Роджерс TW, Janečka JE. Приложения и методы неинвазивных исследований фекальной генетики в области сохранения кошачьих. Eur J Wildl Res. 2013; 59: 1–16.
6. 6.
   Джонсон В.Е., Торрес-Флорес Дж. П., Галетти П. М. младший, Годой Дж. А., Марин Дж. К.. Комплексные генетические подходы к сохранению тропических и субтропических видов.Сохранение тропиков: взгляд на местные и глобальные приоритеты. Издательство Оксфордского университета. Агирре А.А., Сукумар Р.; 2016. С. 226–237.
7. 7.
   Гущанский К., Бдительный Л., МакНейлаж А., Грей М., Кагода Е., Роббинс М. М.. Подсчет неуловимых животных: сравнение полевой и генетической переписи всей популяции горных горилл в Национальном парке Бвинди, Уганда. Биол Консерв. 2009. 142: 290–300.
8. 8.
   Мондол С., Карант К.Ю., Кумар Н.С., Гопаласвами А.М., Андхерия А., Рамакришнан У.Оценка неинвазивных методов генетической выборки для оценки размера популяции тигров. Биол Консерв. 2009. 142: 2350–2360.
9. 9.
   Хеджес С., Джонсон А., Алеринг М., Тайсон М., Эггерт Л.С. Точность, точность и экономическая эффективность традиционных методов исследования плотности навоза и ДНК фекалий для оценки размера и структуры популяции азиатских слонов (Elephas maximus). Биол Консерв. 2013; 159: 101–108.
10. 10.
    Таберлет П., Уэйтс Л. П., Луикарт Г. Неинвазивный генетический отбор: посмотрите, прежде чем прыгать.Trends Ecol Evol. 1999; 14: 323–327. pmid: 10407432
11. 11.
    Morin PA, Chambers KE, Boesch C, Vigilant L. Количественный анализ полимеразной цепной реакции ДНК из неинвазивных образцов для точного микросателлитного генотипирования диких шимпанзе (Pan troglodytes verus). Mol Ecol. 2001; 10: 1835–1844. pmid: 11472550
12. 12.
    Vigilant L. Технические проблемы микросателлитного генотипирования популяции диких шимпанзе с использованием фекалий. Evol Anthropol выпускает новости Rev.2002. 11: 162–165.
13. 13.
    Мерфи М.А., Кендалл К.С., Робинсон А., Уэйтс Л.П. Влияние времени и полевых условий на амплификацию фекальной ДНК бурого медведя (Ursus arctos). Conserv Genet. 2007. 8: 1219–1224.
14. 14.
    Panasci M, Ballard WB, Breck S, Rodriguez D, Densmore LD, Wester DB и др. Оценка методов сохранения фекальной ДНК и влияние возраста образца и диеты на успех генотипирования. J Wildl Manag. 2011; 75: 1616–1624.
15. 15.
    Джеффри К.Дж., Абернети К.А., Тутин CE, Бруфорд М.В.Биологическая и экологическая деградация волос горилл и успех микросателлитной амплификации. Biol J Linn Soc. 2007. 91: 281–294.
16. 16.
    Wultsch C, Waits LP, Hallerman EM, Kelly MJ. Оптимизация методов сбора для неинвазивного отбора генетических образцов неотропических кошачьих. Wildl Soc Bull. 2015; 39: 403–412.
17. 17.
    Ренан С., Спейер Э., Шахар Н., Гета Т., Темплтон А.Р., Бар-Дэвид С. Эксперимент по факторному дизайну в качестве пилотного исследования неинвазивной генетической выборки.Мол Экол Ресур. 2012; 12: 1040–1047. pmid: 22883720
18. 18.
    Францен МАДЖ, Шелк Джей Би, Фергюсон ДжВХ, Уэйн Р.К., Кон М.Х. Эмпирическая оценка методов сохранения фекальной ДНК. Mol Ecol. 1998. 7: 1423–1428. pmid: 9787450
19. 19.
    Nsubuga AM, Robbins MM, Roeder AD, Morin PA, Boesch C, Vigilant L. Факторы, влияющие на количество геномной ДНК, экстрагированной из фекалий обезьян, и определение улучшенного метода хранения образцов. Mol Ecol. 2004. 13: 2089–2094. pmid: 15189228
20. 20.Сото-Кальдерон ID, Ntie S, Mickala P, Maisels F, Wickings EJ, Anthony NM. Влияние типа и времени хранения на успех амплификации ДНК в фекалиях тропических копытных. Мол Экол Ресур. 2009; 9: 471–479. pmid: 21564676
21. 21.
    Стенглейн Дж. Л., Де Барба М., Осбанд ДЕ, Уэйтс Л. П.. Влияние места отбора проб в фекалиях на качество ДНК у двух видов хищников. Мол Экол Ресур. 2010. 10: 109–114. pmid: 21564995
22. 22.
    Аранджелович М., Гущанский К., Шуберт Г., Харрис Т.Р., Тальманн О., Зидель Х. и др.Двухэтапная мультиплексная полимеразная цепная реакция повышает скорость и точность генотипирования с использованием ДНК из неинвазивных и музейных образцов. Мол Экол Ресур. 2009; 9: 28–36. pmid: 21564562
23. 23.
    Бежа-Перейра А., Оливейра Р., Алвес П.К., Шварц М.К., Луикарт Г. Продвижение экологического понимания через технологические преобразования в неинвазивной генетике. Мол Экол Ресур. 2009; 9: 1279–1301. pmid: 21564900
24. 24.
    Хаяиси С., Кавамото Ю. Низкое генетическое разнообразие и смещенное распределение гаплотипов митохондриальной ДНК у японских макак (Macaca fuscata yakui) на острове Якусима.Приматы. 2006; 47: 158–164. pmid: 16418879
25. 25.
    Акомо-Окуэ Э.Ф., Иноуэ Э., Аттеке С., Накашима Ю., Хонго С., Иноуэ-Мураяма М. и др. Неинвазивный генетический анализ для оценки численности видов дукеров среди местообитаний в тропическом лесу Мукалаба, Габон. Mammal Res. 2015; 60: 375–384.
26. 26.
    Рамон-Лака А, Сориано Л., Глисон Д., Годой Дж. Простой и эффективный метод получения ДНК млекопитающих из фекалий. Wildl Biol. 2015; 21: 195–203.
27. 27.Таберле П., Гриффин С., Гуссенс Б., Кестьо С., Манко В., Эскараваж Н. и др. Надежное генотипирование образцов с очень низким содержанием ДНК с помощью ПЦР. Nucleic Acids Res. 1996. 24: 3189–3194. pmid: 8774899
28. 28.
    Хельяр С.Дж., Хеммер-Хансен Дж., Беккевольд Д., Тейлор М.И., Огден Р., Лимборг М.Т. и др. Применение SNP для популяционной генетики немодельных организмов: новые возможности и проблемы. Мол Экол Ресур. 2011; 11: 123–136. pmid: 21429169
29. 29.
    Ранад К., Чанг М-С, Тинг С-Т, Пей Д., Сяо С-Ф, Оливье М. и др.Высокопроизводительное генотипирование с помощью однонуклеотидных полиморфизмов. Genome Res. 2001; 11: 1262–1268. pmid: 11435409
30. 30.
    фон Таден А., Коккиараро Б., Джарауш А., Юнглинг Х., Караманлидис А.А., Тисмейер А. и др. Оценка генотипирования SNP неинвазивно собранных образцов дикой природы с использованием микрофлюидных массивов. Sci Rep.2017; 7: 10768. pmid: 28883428
31. 31.
    Паеткау Д. Эмпирическое исследование качества данных при инвентаризации населения на основе ДНК. Mol Ecol. 2003. 12: 1375–1387.pmid: 12755868
32. 32.
    Фернандо П., Видья TNC, Раджапакс С., Данголла А., Мельник DJ. Надежное неинвазивное генотипирование: фантазия или реальность? J Hered. 2003. 94: 115–123. pmid: 12721223
33. 33.
    Chiou KL, Bergey CM. Обогащение на основе метилирования способствует недорогостоящему неинвазивному секвенированию популяций на основе фекалий в геномном масштабе. Sci Rep.2018; 8: 1975. pmid: 29386638
34. 34.
    Лампа С., Хенле К., Кленке Р., Хоэн М., Грубер Б. Как преодолеть ошибки генотипирования при неинвазивной оценке размера популяции с использованием меток-повторных захватов — обзор доступных методов, проиллюстрированный тематическим исследованием.J Wildl Manag. 2013; 77: 1490–1511.
35. 35.
    Fabbri E, Caniglia R, Mucci N, Thomsen HP, Krag K, Pertoldi C и др. Сравнение однонуклеотидных полиморфизмов и микросателлитов в неинвазивном генетическом мониторинге популяции волков. Arch Biol Sci. 2012; 64: 321–335.
36. 36.
    Фитак Р.Р., Найду А., Томпсон Р.В., Калвер М. Новая панель маркеров SNP для индивидуальной идентификации североамериканских пум. J Fish Wildl Manag. 2015; 7: 13–27.
37. 37.Норман А.Дж., Спонг Г. Оценка рассеивания на основе однонуклеотидного полиморфизма с использованием неинвазивной выборки. Ecol Evol. 2015; 5: 3056–3065. pmid: 26357536
38. 38.
    Гуссенс Б., Шарма Р., Осман Н., Кун-Родригес С., Саконг Р., Анкреназ М. и др. Фрагментация среды обитания и генетическое разнообразие в естественных популяциях борнейского слона: последствия для сохранения. Биол Консерв. 2016; 196: 80–92.
39. 39.
    Schultz AJ, Cristescu RH, Littleford-Colquhoun BL, Jaccoud D, Frère CH.Лучше свежее: точное генотипирование SNP по пометам коалы. Ecol Evol. 2018; 8: 3139–3151. pmid: 29607013
40. 40.
    Аранджелович М., Бдительный Л. Неинвазивная генетическая перепись и мониторинг популяций приматов. Am J Primatol. 2018; 80: e22743. pmid: 29457631
41. 41.
    Сарре С.Д., Жорж А. Генетика в сохранении и управлении дикой природой: революция со времен Коули. Wildl Res. 2009; 36: 70–80.
42. 42.
    Майзельс Ф., Стриндберг С., Блейк С., Виттемайер Г., Харт Дж., Уильямсон Э.А. и др.Разрушительное сокращение численности лесных слонов в Центральной Африке. PloS One. 2013; 8: e59469. pmid: 23469289
43. 43.
    Поулсен Дж. Р., Кернер С. Е., Мур С., Меджиб В. П., Блейк С., Кларк С. Дж. И др. Браконьерство приводит к истощению важнейших дикой природы Центральной Африки от лесных слонов. Curr Biol. 2017; 27: R134 – R135. pmid: 28222286
44. 44.
    Schuttler SG, Philbrick JA, Jeffery KJ, Eggert LS. Тонкомасштабная генетическая структура и загадочные ассоциации свидетельствуют о родственной социальной принадлежности африканского лесного слона.PloS One. 2014; 9: e88074. pmid: 24505381
45. 45.
    Розен С., Скалецкий Х. Primer3 в WWW для обычных пользователей и программистов-биологов. Методы и протоколы биоинформатики. Misener S, Krawetz SA. Humana Press, Тотова, Нью-Джерси; 2000. С. 365–386.
46. 46.
    Кирс М., Мойр Р., Уилсон А., Стоунз-Хавас С., Чунг М., Стуррок С. и др. Geneious Basic: интегрированная и расширяемая настольная программная платформа для организации и анализа данных последовательностей. Биоинформатика.2012; 28: 1647–1649. pmid: 22543367
47. 47.
    Буржуа С., Сенн Х., Каден Дж., Таггарт Дж. Б., Огден Р., Джеффри К. Дж. И др. Открытие однонуклеотидного полиморфизма и панельная характеристика африканского лесного слона. Ecol Evol. 2018; 8: 2207–2217. pmid: 29468037
48. 48.
    Зуур А.Ф., Иено Е.Н., Уокер Н.Дж., Савельев А.А., Смит Г.М. Модели с нулевым усечением и нулевым раздувом для данных подсчета. Модели смешанных эффектов и расширения в экологии с Р. Нью-Йорк: Спрингер; 2009. С.261–293.
49. 49.
    Бурхэм КП, Андерсон ДР. Выбор модели и многомодельный вывод: практический теоретико-информационный подход. Springer Science & Business Media; 2002.
50. 50.
    R Core Team. R: Язык и среда для статистических вычислений. R Фонд статистических вычислений, Вена, Австрия. [Интернет]. 2016.
51. 51.
    Бейтс Д., Мехлер М., Болкер Б., Уокер С. lme4: Линейные модели смешанных эффектов с использованием Eigen и S4. Версия пакета R.2014; 1: 1–12.
52. 52.
    Fournier DA, Skaug HJ, Ancheta J, Ianelli J, Magnusson A, Maunder MN и др. Построитель моделей AD: использование автоматического дифференцирования для статистического вывода сложных нелинейных моделей с высокой степенью параметризации. Программное обеспечение Optim Methods. 2012; 27: 233–249.
53. 53.
    Скауг Х., Фурнье Д., Нильсен А., Магнуссон А., Болкер Б. glmmadmb: Обобщенные линейные смешанные модели с использованием ‘конструктора рекламных моделей’. Пакет R версии 0.8.3.3; 2016.
54. 54.
    Лампа С., Грубер Б., Хенле К., Хон М.Подход к оптимизации для увеличения успеха амплификации ДНК фекалий выдры. Conserv Genet. 2008; 9: 201
55. 55.
    Ратледж Л. Ю., Холлоуэй Дж. Дж., Паттерсон Б. Р., Уайт Б. Н.. Усовершенствованный полевой метод получения ДНК для индивидуальной идентификации из помета волков. J Wildl Manag. 2009. 73: 1430–1435.
56. 56.
    Hedges S, Lawson D. Стандарты обследования навоза для программы MIKE. 2006; Доступно: www.cites.org/eng/prog/MIKE/index.shtml
57. 57.
    Эггерт Л.С., Эггерт Я.А., Вудрафф Д.С.Оценка размеров популяции неуловимых животных: лесных слонов в Национальном парке Какум, Гана. Mol Ecol. 2003; 12: 1389–1402. pmid: 12755869
58. 58.
    Eggert LS, Buij R, Lee ME, Campbell P, Dallmeier F, Fleischer RC и др. Использование генетических профилей африканских лесных слонов для определения структуры популяции, передвижения и использования среды обитания в ландшафте сохранения и развития в Габоне. Conserv Biol. 2014; 28: 107–118. pmid: 24471781
59. 59.
    Серый TN, Видья TNC, Potdar S, Bharti DK, Sovanna P.Оценка размера популяции азиатских слонов в восточной Камбодже с помощью неинвазивной выборки по метке-повторной поимке. Conserv Genet. 2014; 15: 803–810.
60. 60.
    Cullingham CI, Curteanu M, Ball MC, Manseau M. Возможность и рекомендации быстрого профилирования ДНК фекалий лисы. J Wildl Manag. 2010; 74: 849–859.
61. 61.
    Perry GH, Marioni JC, Melsted P, Gilad Y. Захват в геномном масштабе и секвенирование эндогенной ДНК из фекалий. Mol Ecol. 2010; 19: 5332–5344.pmid: 21054605
62. 62.
    Сантини А., Луккини В., Фаббри Е., Рэнди Е. Факторы старения и окружающей среды влияют на успех ПЦР в образцах экскрементов ДНК волка (Canis lupus). Мол Экол Ресур. 2007; 7: 955–961.
63. 63.
    Бринкман Т.Дж., Шварц М.К., Лицо Д.К., Пилигрим К.Л., Хундертмарк К.Дж. Влияние времени и осадков на успех ПЦР с использованием ДНК, выделенной из фекальных гранул оленей. Conserv Genet. 2010; 11: 1547–1552.
64. 64.
    Редди П.А., Бхаванишанкар М., Бхагаватула Дж., Харика К., Махла Р.С., Шиваджи С.Усовершенствованные методы сохранения образцов фекалий хищников, выделения ДНК и количественного определения для точного генотипирования диких тигров. PLoS One. 2012; 7: e46732. pmid: 23071624
65. 65.
    Моде К., Луйкарт Дж., Дубрей Д., фон Харденберг А., Таберле П. Низкая частота ошибок генотипирования в фекалиях диких копытных, взятых зимой. Примечания Мол Экол. 2004. 4: 772–775.
66. 66.
    Монтейро Л., Гра Н., Видал Р., Кабрита Дж., Мегро Ф. Обнаружение ДНК Helicobacter pylori в человеческих фекалиях с помощью ПЦР: стабильность ДНК и удаление ингибиторов.J Microbiol Methods. 2001; 45: 89–94. pmid: 11311393
67. 67.
    Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. Ингибиторы ПЦР — возникновение, свойства и удаление. J Appl Microbiol. 2012; 113: 1014–1026. pmid: 22747964
68. 68.
    Пигготт MP. Влияние возраста образца и сезона сбора на надежность микросателлитного генотипирования фекальной ДНК. Wildl Res. 2005. 31: 485–493.
69. 69.
    Quasim S, McDonald AJ, Sarre SD. На пути к более эффективному крупномасштабному обнаружению хищников наземных млекопитающих по пометам на основе ДНК.Mammal Res. 2018; 63: 387–393.
70. 70.
    Мерфи М.А., Уэйтс Л.П., Кендалл К.С., Вассер С.К., Хигби Дж. А., Богден Р. Оценка методов долгосрочного хранения образцов фекальной ДНК бурого медведя (Ursus arctos). Conserv Genet. 2002; 3: 435–440.
71. 71.
    Matheson CD, Gurney C, Esau N, Lehto R. Оценка ингибирования ПЦР гуминовыми веществами. Open Enzyme Inhib J. 2010; 3: 38–45.
72. 72.
    Коста V, Розенбом С., Монтейро Р., О’Рурк С.М., Бежа-Перейра А.Повышение качества ДНК, выделенной из образцов фекалий — метод повышения выхода ДНК. Eur J Wildl Res. 2017; 63: 3.
73. 73.
    Кэмпбелл Н.Р., Нарум С.Р. Количественная ПЦР-оценка микросателлитного и SNP-генотипирования с экстрактами ДНК различного качества. Conserv Genet. 2009; 10: 779–784.
74. 74.
    Хаускнехт Р., Байерл Х., Гула Р., Куен Р. Применение количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени для неинвазивного генетического мониторинга. J Wildl Manag. 2010; 74: 1904–1910.
75. 75.
    Kanthaswamy S, Premasuthan A, Ng J, Satkoski J, Goyal V. Количественный анализ ПЦР в реальном времени (qPCR) для идентификации видов человека, собаки и кошки и количественного определения ядерной ДНК. Forensic Sci Int Genet. 2012; 6: 290–295. pmid: 21764401
76. 76.
    Ng J, Satkoski J, Premasuthan A, Kanthaswamy S. Определение видов на основе ядерной ДНК и количественный анализ ДНК для обычных видов домашних птиц. J Food Sci Technol. 2014; 51: 4060–4065. pmid: 25477681
77. 77.Кидд К.К., Пакстис А.Дж., Спид У.С., Григоренко Е.Л., Каджуна С.Л., Карома Н.Дж. и др. Разработка панели SNP для судебно-медицинской идентификации физических лиц. Forensic Sci Int. 2006; 164: 20–32. pmid: 16360294
78. 78.
    Пакстис AJ, Speed ​​WC, Fang R, Hyland FC, Furtado MR, Kidd JR и др. SNP для универсальной индивидуальной идентификационной панели. Hum Genet. 2010; 127: 315–324. pmid: 19937056
79. 79.
    Семагн К., Бабу Р., Хирн С., Олсен М. Генотипирование однонуклеотидного полиморфизма с использованием конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP): обзор технологии и ее применения в улучшении сельскохозяйственных культур.Мол Порода. 2014; 33: 1–14.
80. 80.
    Nussberger B, Wandeler P, Camenisch G. Чип SNP для обнаружения интрогрессии у диких кошек позволяет точно генотипировать отдельные волоски. Eur J Wildl Res. 2014; 60: 405–410.
81. 81.
    Болл М.С., Питер Р., Мансо М., Кларк Дж., Петерсен С.Д., Кингстон С. и др. Определение характеристик ядерной ДНК-мишени из фекалий снижает технические проблемы, связанные с предположениями о низком качестве и количестве матрицы. Conserv Genet. 2007. 8: 577–586.
82. 82.Эберт С., Кнауэр Ф., Спилбергер Б., Тиле Б., Хоманн У. Оценка размера популяции кабана Sus scrofa с использованием фекальной ДНК и моделирования отлова-повторной поимки. Wildl Biol. 2012; 18: 142–152.

Новые инструменты для изучения видов слонов

Несмотря на потребность в неинвазивных инструментах для мониторинга популяций диких животных, отбор генетических проб фекалий обычно не используется в качестве инструмента управления дикой природой, в основном из-за связанных с этим технических проблем и стоимости. Оптимизация требуется на всех этапах, от сбора образцов до подготовки ДНК для генотипирования, чтобы повысить рентабельность и качество набора данных.В этом исследовании мы собрали обширный набор образцов фекалий лесных слонов и оценили их пригодность для генетического анализа. С помощью недавно разработанного количественного анализа мы продемонстрировали эффективность новых протоколов отбора проб и экстракции у слонов. Как и ожидалось, количественный анализ ПЦР в реальном времени позволил нам предсказать успех генотипирования и провести предварительный скрининг образцов ДНК.

Оптимизация протоколов отбора проб в полевых условиях

Выбор метода отбора проб и носителя информации имеет решающее значение для последующего успеха генотипирования.Наши результаты показывают, что мазок с поверхности навоза с последующим хранением в буфере для лизиса был эффективным методом отбора проб, что согласуется с предыдущими исследованиями других видов [24,54,55]. Несмотря на эти многообещающие результаты и их удобство в полевых условиях, мазки относительно мало использовались при отборе генетических проб фекалий диких животных [23,26]. Насколько нам известно, это исследование является первым, в котором сообщается об использовании мазков для отбора проб фекалий у слонов, и наблюдаемый успех экстракции ДНК для образцов, собранных в течение 24 часов после дефекации, был высоким (85% в течение 8 недель хранения).Это выше, чем сообщалось в других исследованиях лесных слонов, где от 60 до 80% образцов фекалий, хранящихся в этаноле или в буфере королевского колледжа, рекомендованном программой CITES MIKE (мониторинг незаконного убийства слонов) [56], были успешно используется для микросателлитного генотипирования [9,44,57–59].

Мы обнаружили, что выход целевой ДНК был более чем в 40 раз выше в образцах мазков по сравнению с образцами, сохраненными с использованием двухэтапного метода, независимо от качества фекалий. Исходя из концентрации ДНК слона, мы бы отбросили 79.5% проб отобраны двухэтапным методом перед генотипированием. Только в двух других исследованиях было проведено прямое сравнение тампонов с другими методами отбора проб. Подобно нашим результатам, у непарнокопытных успех генотипирования был почти нулевым при двухэтапном методе и почти 100% при использовании мазков [17]. Сообщалось о более высоком выходе целевой ДНК с мазками по сравнению с хранением этанола у некоторых видов, особенно у травоядных [26].

Высокая эффективность метода взятия мазков, продемонстрированная в нашем исследовании, может быть объяснена методикой отбора образцов.Мы использовали тампон, чтобы очистить всю поверхность навоза, таким образом, получая больше ДНК на образец, чем методы, нацеленные на небольшой кусок внешнего слоя навоза. Это особенно верно для видов с большими пометами или многочисленными гранулами, обеспечивающими большую площадь поверхности [60]. Кроме того, наши результаты продемонстрировали эффективность метода мазка для нацеливания на клетки-хозяева, поскольку доля эндогенной ДНК была высокой по сравнению со значениями, полученными в других исследованиях с использованием образцов фекалий, собранных с помощью других методов [26,61].Мазки нацелены на отторженные кишечные эпителиальные клетки на поверхности помета более конкретно, чем другие методы сбора, тем самым сокращая одновременный сбор пищи или микробного материала [54]. Относительно низкая доля эндогенной ДНК в нашем исследовании (до 29,5%) по сравнению со значениями около 50%, указанными в образцах мазков в другом исследовании [26], может быть ограничена более высокой концентрацией микроорганизмов на поверхности помета в тропических условиях. среда.

Выбор куч навоза, подходящих для отбора проб, является еще одним важным шагом, определяющим успех отбора проб.Мы обнаружили, что на успех экстракции образцов мазков влияла свежесть навозной кучи и воздействие различных факторов окружающей среды, включая УФ-свет, влажность, а также неизмеряемые факторы, такие как температура и наличие микроорганизмов, как и ожидалось в предыдущих исследованиях [13,16, 62,63]. Мы показали, что свежесть оказывает большое влияние на концентрацию ДНК слона и, следовательно, качество образцов для исследований ДНК было оптимальным в течение одного часа после дефекации. Это противоречило предыдущим открытиям на выдре ( Lutra lutra ), где не было обнаружено никаких изменений в течение 20 часов после дефекации [54], но, вероятно, из-за тропической среды, поскольку разложение происходит быстрее, чем в сухой или очень холодной среде [13 ].В нашем исследовании успех экстракции снизился из-за влажной среды (осадки или частичное погружение в воду) и возраста образца навоза, превышающего 24 часа, что также было зарегистрировано у тигров ( Panthera tigris ) [64]. Напротив, воздействие прямых солнечных лучей значительно снижает концентрацию ДНК, но не снижает ее присутствие, и эти образцы подходят для генотипирования. Этот результат можно объяснить нашей техникой отбора проб, поскольку мы протирали мазками только те стороны навоза, которые были затемнены от прямого УФ-излучения.

В нашем исследовании различия между местоположениями и людьми также частично объясняли вариабельность обеих моделей присутствия и концентрации ДНК. Эти различия можно объяснить вариациями в диете, которые известны как фактор, влияющий на успех генотипирования [14]. Предыдущие исследования показали, что качество диеты влияет на время пищеварения и, следовательно, на истирание кишечных клеток, содержащих ДНК хозяина [65], и что некоторые растения или фрукты содержат ингибиторы ПЦР [66,67]. В нашем исследовании виды плодов и доля травы в фекалиях слонов варьировались в зависимости от места отбора проб и сезона (S.Буржуй, личное наблюдение). Необходимы дополнительные исследования, чтобы помочь выбрать кучу навоза, наиболее подходящую для исследований ДНК на основе диеты слона.

Основным результатом нашего исследования является снижение затрат и усилий на создание высококачественного набора генетических данных о фекалиях. Свабирующий материал был более удобным и легким в переноске, занимая минимум места в полевых условиях, что позволяло собирать больше образцов за одну поездку, что на 50% сокращало количество человеко-дней в удаленных районах. Это сильные преимущества для удаленных и труднодоступных полевых участков, таких как тропические леса.Кроме того, высокий успех экстракции снижает целевое количество проб навоза, обычно необходимое для компенсации аналитических сбоев [5], что дополнительно снижает полевые затраты и усилия примерно на 15%. У видов с низкой плотностью и / или ежедневной дефекацией снижение затрат на полевые работы может быть ограничено трудностью поиска свежих образцов навоза (<24 часов). Кроме того, возраст навозных куч может быть трудно оценить в полевых условиях [68]. У этих видов может потребоваться сбор более старых образцов навоза, чтобы увеличить количество собранных образцов, даже если это приводит к увеличению лабораторных затрат из-за снижения скорости извлечения.Пилотное исследование, включающее образцы навоза разного возраста, позволило бы установить разумные пороговые значения возраста навоза для этих видов в качестве баланса между лабораторными затратами и полевыми усилиями.

В лаборатории экстракция ДНК из образцов мазков была быстрой и простой, так как пробирку просто встряхивали в течение 10 секунд и центрифугировали в течение 2 минут, прежде чем мазок был удален. Напротив, выделение ДНК из образцов, собранных с использованием двухэтапного протокола, занимало много времени и сопряжено с более высоким риском заражения из-за необходимости соскоблить или выбрать кусок фекалий перед экстракцией.Количество образцов мазков, которые можно было взять в день на человека, составило 48 с образцами мазков по сравнению с 16 при двухэтапном протоколе, что на 66% снижает затраты на рабочую силу. Это было похоже на результаты предыдущего исследования, показавшего, что выделение ДНК из мазков связано с более быстрым временем обработки и позволяет работать с партиями большего размера [69].

Отмеченные преимущества отбора проб свежего фекального материала с точки зрения успеха лаборатории также следует учитывать в связи с увеличением усилий по поиску достаточного количества проб этого типа, в отличие от более мягких критериев для сбора фекального материала в любых условиях.Всегда существует компромисс с точки зрения стоимости проекта между сбором проб и лабораторным анализом. Лабораторный анализ проще, быстрее и дешевле при использовании надежных источников образцов ДНК, но, хотя это приводит к предпочтению инвазивных типов образцов перед неинвазивными образцами и свежего неинвазивного фекального материала по сравнению с более старым материалом, эффективность лаборатории благодаря высокому качеству образцов может быть компенсировано повышенными полевыми расходами. Однако у этого компромисса есть жесткие границы. Так же, как считается совершенно непрактичным (с финансовой и этической точки зрения) усыпить диких лесных слонов, чтобы получить образец ДНК наилучшего качества, просто невозможно выполнить анализ ДНК на образцах, в которых ДНК полностью разрушена.По мере приближения к этому моменту стоимость анализа ДНК возрастает, но также, что важно, качество получаемых генетических данных и их полезность для биологических выводов снижаются. Этот вопрос качества данных часто упускается из виду из-за простого компромисса между лабораторными и полевыми расходами. Поэтому мы утверждаем, что более высокие усилия по поиску свежих образцов в полевых условиях на самом деле являются требованием, а не сбалансированным выбором, если альтернативой является сбор образцов, которые не только очень дороги для обработки в лаборатории, но и только дают данные предельной биологической ценности.Важно, чтобы этот вопрос широко понимался для улучшения планирования полевых работ и управления ожиданиями менеджеров по охране дикой природы и доноров, когда они приступают к реализации генетических проектов по сохранению.

Оптимизация подготовки образцов

Мы подчеркнули важность подготовки образцов, включая хранение образцов фекалий перед выделением ДНК и разбавление образцов ДНК перед генотипированием, исследуя влияние времени хранения и степени разведения на успех генотипирования. Мы показали, что время хранения отрицательно влияет на успех экстракции ДНК, и использовали это соотношение, чтобы дать рекомендации по максимальному времени хранения.Концентрация ДНК слона также снижалась с увеличением времени хранения, даже если образцы сильно различались. Прогнозируемый успех выделения фекальной ДНК снизился до уровня ниже 75% через два месяца и до 50% через пять месяцев. Этот результат был аналогичен другим исследованиям, которые показывают значительное снижение успешности генотипирования после одного-трех месяцев хранения независимо от носителя [20,70]. Показатели успешности ПЦР 75% были получены для экстрактов ДНК, хранящихся до четырех месяцев, и 50% для экстрактов, хранящихся более шести месяцев, когда образцы навоза отбирались в течение 1 часа после осаждения.Это подчеркивает важность выбора как можно более свежего навоза, хотя, по общему признанию, это не всегда практично для неуловимых видов. Некоторые авторы предлагают удалить ватный тампон для длительного хранения [55]. Хранение образцов при более низкой температуре, например -80 ° C, также может замедлить деградацию ДНК. Однако мы считаем, что короткое время хранения является ключевым фактором успеха генетических исследований.

Тщательное планирование лабораторных анализов перед проведением полевых работ имеет первостепенное значение для ограничения времени хранения и повышения успешности выделения ДНК.Создание внутри страны потенциала для извлечения ДНК в стране-источнике позволит обрабатывать образцы по мере их сбора, что особенно важно в исследованиях, предполагающих длительный период полевых исследований, когда регулярный экспорт образцов нецелесообразен. Необходимые вложения в базовое оборудование и обучение разумны. Лаборатория экстракции ДНК может быть размещена в одном помещении, оборудованном стендом, набором пипеток, центрифугой, инкубатором, вортексом и морозильной камерой (общая стоимость <6000 долларов США) и готовыми наборами для выделения ДНК.Обучение лаборанта извлечению ДНК возможно в течение пары недель.

Помимо низкого успеха экстракции, приводящего к отсутствию или недостаточному выходу целевой ДНК, присутствие ингибиторов является второй наиболее частой причиной неудач амплификации в образцах фекалий в утвержденных условиях ПЦР [3]. Наше исследование подчеркнуло необходимость проведения пилотного исследования для определения оптимального разведения перед генотипированием. Пилотное исследование показало, что 10-кратное разведение увеличивает успех генотипирования, что было аналогично предыдущему исследованию на азиатских слонах [38].Оптимальное разведение представляет собой компромисс между подходящим разбавлением ингибиторов в образцах с высоким выходом ДНК при минимальном риске разведения ДНК в образцах с низким выходом ДНК. Однако в нашем исследовании значительная часть элюатов ДНК (14,5%) имела коричневый цвет, который часто связан с присутствием ингибиторов, таких как гуминовые примеси [71]. Эти образцы нельзя было количественно определить с помощью ПЦР-анализа при любой степени разбавления. Поскольку происхождение этих образцов было сосредоточено в 5 участках (2 участка в устье, 1 участок вдоль побережья, Лопе и озера), мы полагаем, что это было связано с различиями в рационе, а не с методом отбора проб.Было обнаружено, что метод мазка минимизирует количество ингибиторов ПЦР [26]. Дальнейшие исследования должны быть направлены на улучшение протоколов экстракции, в частности этапов очистки, чтобы оптимизировать удаление ингибиторов [72].

Предварительный скрининг образцов ДНК перед генотипированием

Мы обнаружили, что, несмотря на оптимизированные протоколы сбора, хранения и экстракции образцов, качество и количество ДНК, извлеченной из куч навоза, сильно различались по образцам. Следовательно, предварительная оценка образцов была необходима для повышения общего успеха генотипирования и снижения риска ошибок.Выход целевой ДНК был хорошим предиктором успеха генотипирования, как показано в предыдущих исследованиях [11,22,73,74]. Когда вид происхождения трудно подтвердить визуальным осмотром помета (например, у плотоядных животных), требуется предварительная идентификация вида, часто включающая секвенирование митохондриальной ДНК [16,60]. Двухэтапный подход, начинающийся с секвенирования митохондриальной ДНК для информирования о последующем выборе подходящего количественного ПЦР-анализа для конкретных видов, может быть экономически эффективным методом предварительного скрининга образцов на основе концентрации.Это потребует тщательного тестирования специфичности праймеров, чтобы убедиться, что они не амплифицируют ДНК родственных видов [75,76]. В качестве альтернативы, одноэтапный вариант мог бы заключаться в дифференциации между несколькими видами (например, плотоядными) путем комбинирования праймеров ПЦР, типичных для хищников, с анализом кривой плавления, дискриминационным по видам, в одном анализе qPCR.

Путем моделирования двух различных сокращенных панелей из 15 и 40 SNP с использованием локусов высокого качества и количества локусов, обычно используемых для индивидуальной идентификации или анализа происхождения [77,78], мы показали, что взаимосвязь между концентрацией целевой ДНК и успехом генотипирования варьировалась в зависимости от количества маркеров и отдельных локусов.Наш подход был консервативным, так как мы не пересчитывали график генотипа вручную. Это увеличило бы успех генотипирования, потому что автоматический вызов аллеля приводит к высокой доле неназначенных вызовов генотипа [79]. Несмотря на это, мы обнаружили, что для достижения 80% успеха генотипирования требовалось очень небольшое количество ДНК на реакцию (22,5 или 45 пг ДНК на реакцию с панелью из 15 или 40 SNP соответственно). Эти значения были ниже пороговых значений, указанных для микросателлитного и SNP-генотипирования (50–200 пг на реакцию) в предыдущих исследованиях [11,22,60,80].Различия в пороговых значениях между исследованиями объясняются различиями в типах маркеров [73], выбором метода генотипирования [35] и представляющими интерес видами [74]. Как следствие, пороговые значения для категоризации выборки необходимо устанавливать в каждом конкретном случае для каждого вида и набора маркеров. Наше исследование еще раз подчеркнуло необходимость проведения пилотного исследования [10,34] для установления разумных пороговых значений. Пилотное исследование также позволит оценить долю образцов плохого качества и решить, следует ли их отбрасывать или генотипировать в повторностях, как баланс между затратами и необходимостью выбора подходящего размера.

Использование количественной ПЦР долгое время ограничивалось стоимостью оборудования и реагентов [34], но теперь этот метод стал доступным [23]. Отказ от образцов, которые вряд ли дадут жизнеспособные результаты до генотипирования, снижает затраты на генотипирование и риск ошибок. Количественная оценка ДНК (реагенты и планшеты) стоит примерно 1 доллар США за образец, не считая затрат на рабочую силу, и позволила нам снизить общие затраты на генотипирование более чем на треть. Необходимость в предварительном отборе проб еще выше у видов, у которых возраст навозных куч трудно оценить в полевых условиях [68], что приводит к увеличению доли неподходящих проб.